Este protocolo describe un sistema de aire de sobrepresión personalizado diseñado para inducir lesiones del sistema nervioso central (SNC) de sistema cerrado en ratones, incluidos traumatismos oculares, cerebrales y de la médula espinal. El objetivo de este protocolo es proporcionar un marco para que los investigadores adapten y amplíen fácilmente el sistema para sus estudios únicos de trauma en el SNC.
La prevalencia de lesiones del sistema nervioso central (SNC) de sistema cerrado subraya la necesidad de una mayor comprensión de estos traumas para mejorar las intervenciones protectoras y terapéuticas. Cruciales para esta investigación son los modelos animales que replican lesiones del SNC de sistema cerrado. En este contexto, se diseñó un sistema de aire de sobrepresión personalizado para reproducir una serie de lesiones del SNC de sistema cerrado en modelos murinos, incluidos los traumatismos oculares, cerebrales y de la médula espinal. Hasta la fecha, el sistema se ha utilizado para administrar aire de sobrepresión dirigido a los ojos, la cabeza o la columna vertebral para modelar la lesión del polo anteroposterior en el ojo, la neuropatía óptica traumática indirecta (ITON), la lesión cerebral traumática focal y la lesión de la médula espinal. Este documento proporciona un protocolo detallado que describe el diseño y la operación del sistema y comparte resultados representativos que demuestran su efectividad. El marco sólido que se presenta aquí proporciona una base sólida para la investigación en curso sobre el trauma del SNC. Al aprovechar los atributos flexibles del sistema, los investigadores pueden modificar y controlar cuidadosamente la ubicación, la gravedad y el momento de las lesiones. Esto permite comparaciones exhaustivas de los mecanismos moleculares y la eficacia terapéutica en múltiples lesiones del SNC de sistema cerrado.
Las lesiones del sistema nervioso central (SNC) de sistema cerrado son lesiones causadas por daños en el cerebro o la médula espinal sin causar una ruptura en el cráneo o la columna vertebral. Estas lesiones incluyen lesiones cerebrales traumáticas (TBI, por sus siglas en inglés) y lesiones de la médula espinal (SCI, por sus siglas en inglés) y pueden ocurrir por una variedad de incidentes, incluidas lesiones por fuerza contundente (por ejemplo, caídas, lesiones deportivas, accidentes automovilísticos) y explosiones explosivas. Las lesiones del SNC de sistema cerrado generalmente se consideran menos graves en comparación con las lesiones penetrantes del SNC, sin embargo, ocurren con más frecuencia. Sin embargo, al igual que las lesiones penetrantes, las lesiones del SNC de sistema cerrado pueden provocar problemas de salud progresivos y a largo plazo, especialmente después de repetidas ocurrencias 1,2,3,4,5,6. De manera preocupante, la evidencia emergente sugiere que incluso las lesiones subclínicas del SNC de sistema cerrado, que caen por debajo de los criterios diagnósticos para un TCE o una lesión de la médula espinal después de una sola ocurrencia 7,8,9,10,11,12,13, pueden evolucionar a enfermedades neurodegenerativas crónicas después de lesiones repetidas 6,14,15,16. Esto pone de relieve la urgente necesidad de comprender mejor los mecanismos y las consecuencias de las lesiones únicas y repetidas del SNC en régimen cerrado y reiterado. Este conocimiento es imprescindible para mejorar los enfoques protectores y terapéuticos. Cruciales para este esfuerzo son los modelos animales que replican lesiones del SNC de sistema cerrado.
Los modelos animales actuales de lesiones del SNC en sistema cerrado han sido fundamentales para avanzar en nuestra comprensión de la fisiopatología y las posibles intervenciones protectoras y terapéuticas para estos traumatismos. Los roedores son particularmente populares debido a su bajo costo, disponibilidad, manipulabilidad genética, facilidad de manejo, ensayos conductuales y fisiológicos bien establecidos, y consideraciones éticas más favorables17. Los métodos comunes para inducir un traumatismo craneoencefálico de sistema cerrado en roedores incluyen dispositivos de caída de peso18,19, dispositivos de impacto cortical controlado (CCI)20 y tubos de choque impulsados por aire de compresión21. En el caso de la LME, los modelos de traumatismo cerrado suelen requerir laminectomía22,23 u otras técnicas quirúrgicas24 para acceder directamente a la médula espinal o al espacio epidural. Sin embargo, se han desarrollado modelos de lesiones por explosiones de SCI de cuerpo cerrado utilizando tubos de choque accionados por aire de compresión 25. A pesar de proporcionar información valiosa, cada uno de estos modelos tiene limitaciones únicas. Los modelos de caída de peso pueden tener una alta variabilidad y un control limitado de la localización y la gravedad de la lesión, lo que genera preocupaciones experimentales y éticas por causar lesiones graves e incontroladas26. Los dispositivos CCI ofrecen precisión, pero requieren entrenamiento para operar, pueden implicar una craneotomía y pueden sufrir una variabilidad mecánica que afecta la reproducibilidad27. Los tubos de choque son generalmente menos invasivos, pero pueden ser difíciles de adquirir, complejos de instalar y operar, y pueden crear condiciones de lesión poco realistas y muy variables debido a factores ambientales, reflejos de ondas e interacciones de presión complejas28.
Para estudiar mejor los mecanismos y efectos de las lesiones únicas y repetidas del SNC en sistema cerrado y sus tratamientos, este artículo presenta un método modular, fácil de usar, rentable y no invasivo. El objetivo principal de este enfoque es permitir un control preciso y una modificación flexible de los parámetros de la lesión, incluida la ubicación, la gravedad y el momento. Para respaldar este objetivo, este manuscrito proporciona un protocolo detallado para construir, calibrar y solucionar problemas de un sistema de aire a sobrepresión, que aborda algunas de las limitaciones de los dispositivos de lesión del SNC de sistema cerrado existentes. Este sistema no solo ofrece rentabilidad y un tiempo de configuración mínimo, sino que es muy versátil, ya que proporciona resultados consistentes y reproducibles, al tiempo que minimiza las preocupaciones éticas y maximiza la relevancia clínica. Además, se describe la capacidad del sistema para producir una gama de lesiones del SNC de sistema cerrado en modelos murinos, junto con sus posibles aplicaciones en estudios futuros. En particular, el objetivo de este manuscrito es proporcionar un marco que permita a los investigadores adquirir, adaptar y expandir fácilmente este sistema para sus necesidades específicas, promoviendo así la investigación en curso sobre el trauma del SNC. También se presentan resultados representativos que demuestran la eficacia del sistema en la inducción de trauma axonal.
Este sistema de aire de sobrepresión personalizado es una herramienta útil para estudiar las lesiones del SNC del sistema cerrado en modelos murinos. Los resultados representativos del experimento de ejemplo demuestran que el suministro focal de aire a sobrepresión utilizando este sistema puede inducir eficazmente la ITON, lo que resulta en una pérdida y degeneración significativa de los axones. Esto pone de manifiesto la capacidad del sistema para producir lesiones precisas y reproducibles en el SNC.
Una de las principales fortalezas de este sistema es su capacidad de personalización para inducir una variedad de lesiones del SNC. La gravedad de la lesión se puede ajustar modificando la presión de salida general del sistema, la distancia del animal desde el extremo del cañón utilizando la etapa de posicionamiento x-y, el tamaño y la forma de la apertura de exposición, el número de exposiciones al aire a sobrepresión y el intervalo entre exposiciones. Además, la ubicación de la lesión del SNC se puede ajustar modificando la ubicación de la apertura de exposición dentro del soporte del animal. Esta versatilidad ha permitido que el sistema produzca un espectro de lesiones del SNC de sistema cerrado en modelos murinos. Inicialmente, el sistema se utilizó para modelar lesiones de globo cerrado, centrándose en el daño de los polos anterior y posterior y los déficits relacionados34,36, incluidos los impactos de la respuesta del sistema inmunitario37, los resultados específicos de la tensión38 y la eficacia de los agentes neuroprotectores39. Eventualmente, esta aplicación se amplió para evaluar las secuelas de las exposiciones repetidas dirigidas a los ojos para modelar la neuropatía óptica traumática indirecta (ITON)30 y explorar el efecto del número y el intervalo entre exposiciones repetidas33. Desde entonces, la aplicación del sistema se ha expandido para modelar la lesión cerebral traumática leve (mTBI) de cabeza cerrada a través de exposiciones dirigidas a la cabeza40,41 y la lesión de la médula espinal de cuerpo cerrado (SCI) a través de exposiciones dirigidas al dorso42, lo que enfatiza la adaptabilidad y versatilidad del dispositivo en el estudio de diversos dominios de lesiones del SNC.
Al utilizar este sistema, es fundamental tomar medidas para minimizar la variabilidad en los resultados de las lesiones para garantizar la reproducibilidad y la fiabilidad de los resultados experimentales. Las medidas clave incluyen la calibración de los niveles de presión de salida del sistema antes y después de cada serie de tres exposiciones para garantizar un suministro de presión constante. Aunque la variabilidad es baja cuando el sistema se opera entre 15 psi y 50 psi cuando se usa aire comprimido34, la calibración constante ayuda a detectar errores inesperados, como batería baja o aire bajo. Además, coloque cada animal a la misma distancia del extremo del cañón para garantizar una magnitud de sobrepresión constante, ya que la intensidad de la onda de presión disminuye con la distancia. La posición uniforme también garantiza que cada animal se vea afectado por la misma parte de la onda de radio. Además, la fijación uniforme de los animales dentro del soporte garantiza que el tejido de interés se dirija de forma coherente, especialmente en modelos de exposición repetida cuando existe riesgo de movimiento. Por último, la uniformidad en la edad, el sexo y los antecedentes genéticos de los animales es crucial, ya que estos factores influyen en la respuesta a las lesiones. Por ejemplo, estudios anteriores que utilizaron este sistema compararon los efectos de la sobrepresión del aire dirigido a los ojos en diferentes cepas de ratones, destacando diferencias significativas en la respuesta a las lesiones entre los ratones C57Bl/6J36, DBA/2J37 y Balb/c38 . Los ratones DBA/2J y Balb/c mostraron patologías del polo anterior más severas, mayor daño retiniano, mayor estrés oxidativo y respuestas neuroinflamatorias más pronunciadas en comparación con los ratones C57Bl/6J con ratones Balb/c que mostraron perfiles de lesiones particularmente robustos y duraderos38.
Solución de problemas del sistema
Si los valores de presión son inusualmente bajos para una configuración de manómetro determinada, apriete el gatillo 5-10 veces, permitiendo que el aire pase a través del sistema y que el regulador se ajuste a una nueva configuración. No debe haber fugas en el tanque de aire. La junta tórica del tanque de aire no debe estar dañada ni desgastada, el tanque de aire debe tener suficiente aire y la batería del arma no debe agotarse. La mesa x-y no debe haberse desplazado de su posición habitual desde el extremo del cañón y la apertura de exposición al aire a sobrepresión debe estar alineada con el cañón del arma y no ocluyéndola. El regulador debe estar firmemente asegurado a la empuñadura de la pistola. Si los valores de presión son demasiado bajos a pesar de usar la configuración más alta en el manómetro, el manómetro no debe aumentarse más allá de 200 psi y la configuración de velocidad de la pistola debe ajustarse a la configuración máxima. Si los ajustes de presión son inconsistentes (por ejemplo, alta y luego baja), asegúrese de que el tanque de aire tenga suficiente aire, que el regulador esté bien asegurado a la empuñadura de la pistola, que no haya fugas en el tanque de aire y que esté bien atornillado, y que la junta tórica del tanque de aire no esté dañada ni desgastada.
Para comprender de manera integral todas las capacidades de este sistema, es importante reconocer sus limitaciones. Imitar escenarios del mundo real en un entorno de laboratorio sigue siendo un desafío. Aunque este sistema genera aire a sobrepresión, no replica la compleja dinámica de un evento explosivo, como los gradientes variables de presión y temperatura, la presencia de escombros y ondas reflejadas, y una naturaleza multifásica. Además, no imita una forma de onda de Friedlander (“onda expansiva primaria”), que se caracteriza por un pico agudo y casi instantáneo de presión seguido de un rápido decaimiento exponencial que cae por debajo de la presión ambiental antes de volver a la línea de base43. Más bien, la forma de onda producida por este sistema representa un perfil más simple y simétrico en el que hay un aumento y una disminución más graduales de la presión sin una fase negativa distinta (ver Figura 2C en Hines-Beard et al.34). De manera algo ventajosa, esta forma de onda combina elementos de lesiones por explosión y contundentes. El “pulso de presión” en forma de campana proporciona un impacto de sobrepresión constante, similar a una “pared de aire” que golpea al sujeto. Sin embargo, la sobrepresión de aire suministrada por la onda también es un aspecto característico clave de las lesiones por explosión. Algunos pueden argumentar que, si bien esta forma de onda incluye aspectos de ambos tipos de lesiones, no capta completamente la complejidad de ninguno de ellos. Sin embargo, este “pulso de presión” consistente y reproducible es ideal para experimentos controlados en un entorno de laboratorio para estudiar la lesión focal del SNC en sistema cerrado. Hemos demostrado la naturaleza focal de la lesión anteriormente. Por ejemplo, la exposición a un ojo no causa daño al epitelio nasal primario ni al cerebro44. Además, cuando se dirige hacia el lado de la cabeza del ratón, una pequeña área del cerebro se ve afectada45. Finalmente, la energía del aire a sobrepresión de este sistema al nivel de presión utilizado para ITON no afectó al ratón a menos que se repitiera con un corto intervalo de tiempo33. Por lo tanto, la presión no es perjudicial y, por lo tanto, no replica la fuerza del extremo del chorro. Además, incluso con la exposición repetida del aire a la sobrepresión del ojo, no hubo ningún efecto sobre las estructuras anteriores del ojo33. La degeneración significativa del nervio óptico y la pérdida de visión solo ocurrieron con la exposición repetida con un intervalo entre exposiciones de menos de 1 min33.
En comparación con otros dispositivos de laboratorio para crear lesiones del SNC en sistemas cerrados, este sistema ofrece beneficios únicos. Puede emitir ráfagas secuenciales de aire a sobrepresión en rápida sucesión (intervalos de 0,5 s)33, imitando las condiciones en entornos laborales de alto riesgo donde las exposiciones rápidas a explosiones son un peligro común. Por ejemplo, el personal militar, tanto en escenarios de entrenamiento como de combate, utiliza una gran cantidad de armas de fuego automáticas capaces de disparar rápidamente y repetidas, incluidos rifles automáticos (por ejemplo, M16, AK-47), ametralladoras (por ejemplo, M2 calibre .50), ametralladoras Gatling y ametralladoras. Otras armas más lentas pero repetitivas utilizadas por el personal militar incluyen artillería, morteros, granadas y dispositivos explosivos improvisados (IED). Los trabajadores de demolición que participan en la demolición controlada y los mineros que participan en operaciones de voladura para romper la roca y extraer minerales también experimentan voladuras secuenciales en rápida sucesión. Por último, los trabajadores de la construcción que utilizan herramientas neumáticas, martinetes u otros equipos pesados que generan poderosas fuerzas de percusión pueden experimentar impactos rápidos y repetidos que imitan la exposición a las explosiones. En particular, el suministro rápido de aire a sobrepresión no es posible con dispositivos como los tubos de choque que requieren una reconfiguración extensa o una represurización entre cada evento. Los tubos de choque usan diafragmas que estallan para generar ondas de choque, y después de cada ráfaga, el diafragma debe ser reemplazado. Este proceso lleva tiempo, ya que se debe abrir el tubo de choque, quitar el diafragma gastado, instalar un nuevo diafragma y darle tiempo al sistema para reiniciar y represurizar. Por lo tanto, especialmente para los estudios que investigan la lesión del SNC después de una exposición rápida y repetida a explosiones, es ideal un sistema que no requiera una reconfiguración extensa o una nueva presurización entre cada evento.
Las aplicaciones futuras de este sistema modulador, fácil de usar y rentable son prometedoras. Aprovechando sus atributos adaptables y únicos, este sistema abre varias vías prometedoras para futuros estudios terapéuticos preclínicos. Su capacidad para emitir ráfagas rápidas y secuenciales de aire a sobrepresión puede aprovecharse para estudiar los efectos acumulativos de las exposiciones repetidas a explosiones, lo que es relevante para comprender la encefalopatía traumática crónica y otras afecciones neurodegenerativas a largo plazo. Además, este sistema se puede utilizar para explorar la eficacia de diversas intervenciones farmacológicas destinadas a mitigar las lesiones del SNC de sistema cerrado, incluido el momento y la dosificación de los fármacos neuroprotectores para determinar las ventanas de tratamiento óptimas. Además, la precisión del sistema en la imitación de aspectos de los mecanismos de lesiones tanto contundentes como por explosión permite el desarrollo de modelos de lesiones integrales que reflejan el trauma complejo experimentado por las personas en escenarios del mundo real. Esto puede facilitar la prueba de terapias multimodales que aborden aspectos globales comunes de las lesiones, como la inflamación, el estrés oxidativo y la muerte neuronal. En general, este dispositivo ofrece una plataforma versátil y potente para avanzar en nuestra comprensión de las lesiones del SNC de sistema cerrado y desarrollar intervenciones terapéuticas efectivas.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la financiación del NIH NEI P30 EY008126, la Beca Potocsnak para el Descubrimiento en Medicina Regenerativa, el Fondo del Mayor General Retirado Stephen L. Jones, MD, y los Fondos No Restringidos (VEI) de Research Prevent Blindness, Inc.
1-Pentanol | Fisher Scientific | AC160600250 | Used to make Avertin solution |
2,2,2-tribomoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | Used to make Avertin solution |
24-well plates with lid | VWR | 76520-634 | 24-well plate |
2-Propanol | Fisher Scientific | A451-1 | |
50 kS/s/channel Bridge Analog Input Module | National Instruments | NI-9237 | DAQ module |
Albumin Bovine Fraction V (BSA) | Research Products International | A30075 | BSA |
Anti-Iba1 Primary Antibody (Goat polyclonal) | Abcam | ab5076 | Marker for microglia, Used at 1:500 concentration |
Anti-Synaptophysin Primary Antibody (Mouse monoclonal) | Abcam | ab8049 | Marker for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:20 concentration |
Araldite GY 502 | Electron Microscopy Sciences | 10900 | |
Cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
Charcoal Filter Canister | E-Z Systems | EZ-258 | Collection of anesthetic waste |
Clear H20 DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | Used post blast to aid animal recovery |
CompactDAQ Chassis | National Instruments | USB-9162 | DAQ chassis |
Compressed Air | A-L Gas | GSMCA300 | Used to refill pressurized air tank |
DAPI Fluoromount-G | Southern Biotech | Mounting media with DAPI | |
Diamond knife | Micro Star Technologies, Group of Bruker Nano, Inc. | For sectioning optic nerves, 3 mm/45 degrees/Style H | |
Donkey Anti-Goat IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594 | Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific) | A-11058 | Secondary antibody for microglia, Used at 1:200 concentration |
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594 | Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific) | A-21203 | Secondary antibody for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:200 concentration |
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 488 | Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific) | A-21206 | Secondary antibody for rod bipolar cells, Used at 1:200 concentration |
Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9662 | NDS |
Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Fine forceps for whole eye enucleation |
Ethanol (200 proof) | KOPTEC (Supplier: VWR) | 89125-188 | Ethanol |
Fluoromount-G | Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific) | 00-4958-02 | Mounting media |
Genteal Tears Ophthalmic Gel | Covetrus | 72359 | Eye lubricant to prevent eyes from drying out during/after anesthesia |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16200 | |
Graduated Cylinder 1000 mL | Fisher Scientific | 08-572G | |
Graduated Cylinder 250 mL | Fisher Scientific | 08-572E | |
Graduated Cylinder 500 mL | Fisher Scientific | 08-572F | |
Heating pad | Braintree Scientific | AP-R 26E | Controlled heating support |
High Pressure Fill Station | Ninja Paintball | HPFSV2 | Used to refill pressurized air tank |
ImageJ | National Institutes of Health | Image analysis software | |
Invert Mini | Empire Paintball | Paintball gun | |
Isoflurane | Covetrus | 29405 | Inhalation anesthetic |
Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | Animal anesthesia |
Masterflex Pump | Cole-Parmer | Used for animal perfusion | |
Methanol | Sigma Aldrich | 322415-2L | |
Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | White glass microscope slides |
NI LabVIEW | National Instruments | Software to acquire data from DAQ system (other examples include Matlab, Python, or other softwares provided by different DAQ hardware manufacturers) | |
NI Measurement and Automation Explorer (NI MAX) | National Instruments | Software to configure DAQ system settings | |
NI-DAQmx drivers | National Instruments | Driver for interacing with DAQ system | |
Nikon Eclipse Ni-E microscope | Nikon Instruments | ||
Osmium tetroxide 2% | Electron Microscopy Sciences | 19152 | |
Paraformaldehyde 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | PFA diluted down to 4% |
Paraphenylenediamine | Sigma Aldrich | P6001 | |
PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | PBS diluted down to 1x |
Propylene oxide | Electron Microscopy Sciences | 20401 | |
PROV3 48 L, 48 in3 Aluminum 3000 psi Rated Tank | Ninja Paintball | Pressurized air tank | |
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 1000 mL | Fisher Scientific | 06-414-1D | |
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 500 mL | Fisher Scientific | 06-414-1C | |
Pyrex Reusable Media Storage Bottles 250 mL | Fisher Scientific | 06-414-1B | |
Recombinant Anti-PKC-a Primary Antibody (Rabbit monoclonal) | Abcam | ab32376 | Marker for rod bipolar cells, Used at 1:500 concentration |
Resin 812 | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
Series TJE Pressure Transducer, 100 psi | Honeywell | 060-0708-10TJG | Consider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements |
Sucrose | Sigma Aldrich | S5016 | |
Super TJE Pressure Transducer, 7500 psi | Honeywell | Consider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements | |
Syringe/Needle Combo | Covetrus | 60728 | Syringe/Needle to perform IP injections |
Tissue-Plus OCT Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Freezing medium |
Toluidine blue | Fisher Scientific | BP107-10 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
UniSlide XY Table | Velmex | AXY40 Series | XY positioning table |
University Brush – Series 233- Round, Size 000 | Winsor and Newton | Paintbrush | |
Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | Scissors for whole eye enucleation |
Virtual Instrument | National Instruments | Digital tool for data acquisition software |