Mediciones de microscopía de fuerza atómica de cartílago en extremidades de ajolote intactas y en regeneración
Summary
En este protocolo, mostramos cómo preparar tejido de ajolote para microscopía de fuerza atómica (AFM) y realizar mediciones de indentación en cartílago de extremidades intacto y en regeneración.
Abstract
Las fuerzas mecánicas proporcionan señales importantes para la función celular normal y la formación de patrones en los tejidos en desarrollo, y su papel ha sido ampliamente estudiado durante la embriogénesis y la patogénesis. Comparativamente, se sabe poco de estas señales durante la regeneración animal.
El ajolote es un organismo modelo importante para el estudio de la regeneración, dada su capacidad para restaurar completamente muchos órganos y tejidos después de una lesión, incluidos los cartílagos y huesos faltantes. Debido a su papel crucial como principal tejido de soporte en el cuerpo de los vertebrados, la recuperación de la función esquelética durante la regeneración requiere tanto la restauración de las estructuras faltantes como sus propiedades mecánicas. Este protocolo describe un método para procesar muestras de extremidades de ajolote para microscopía de fuerza atómica (AFM), que es el estándar de oro para sondear las propiedades mecánicas de células y tejidos a alta resolución espacial.
Aprovechando las capacidades regenerativas del ajolote, este estudio midió la rigidez del cartílago de la extremidad durante la homeostasis y dos etapas de la regeneración de la extremidad: la histólisis tisular y la condensación del cartílago. Demostramos que la AFM es una herramienta valiosa para obtener información sobre la reestructuración dinámica de los tejidos y los cambios mecánicos que ocurren durante la regeneración.
Introduction
El esqueleto, especialmente el cartílago y los huesos, proporciona el principal soporte mecánico para los tejidos blandos del cuerpo en los vertebrados. Por lo tanto, es probable que cualquier daño en el sistema esquelético comprometa en gran medida la funcionalidad e incluso la supervivencia. En los seres humanos, las fracturas óseas son una de las lesiones traumáticas más comunes1, la mayoría de las cuales se reparan en cuestión de semanas, pero entre el 5% y el 10% de ellas tendrán retrasos en la curación o nunca se recuperarán por completo 2,3. Además, los seres humanos no son capaces de recuperarse de una pérdida extensa de hueso o cartílago 4,5. Algunas salamandras, sin embargo, pueden regenerar una variedad de estructuras corporales,incluidas las extremidades completas, lo que las convierte en un modelo ideal para el estudio de la regeneración esquelética.
El ajolote (Ambystoma mexicanum) es un tipo de salamandra cuya regeneración de extremidades ha sido ampliamente estudiada. Este proceso ocurre en cuatro fases principales secuenciales pero superpuestas: 1) cicatrización de heridas, 2) inflamación/histólisis, 3) formación de blastema y 4) crecimiento/diferenciación del blastema (revisado en 7,8). Después de la amputación, los queratinocitos que bordean el sitio de la lesión migran rápidamente, cerrando la herida y formando el epitelio de la herida (WE). Durante la inflamación y la histólisis subsiguientes, se eliminan los patógenos, se eliminan los residuos y las células dañadas, y se remodela la matriz extracelular (MEC) debajo de la superficie de amputación9. La histólisis tisular es esencial para que se produzca la regeneración de la extremidad10, donde la secreción de enzimas proteolíticas es crucial no solo para la remodelación general de la MEC, sino también para la liberación de las células que dan lugar al blastema y para la liberación de moléculas bioactivas secuestradas en la propia MEC8. De hecho, los estudios en muchos contextos regenerativos y organismos modelo han demostrado que las propiedades materiales únicas de la MEC durante la histólisis son capaces de inducir procesos de desdiferenciación o dirigir la migración de las células hacia el sitio de la lesión (revisado en11). Además, la reabsorción del tejido calcificado durante las últimas etapas de la histólisis ha demostrado ser clave para la correcta integración de los elementos esqueléticos de las extremidades recién formados12. Después de la etapa de histólisis, el blastema se forma debajo del epitelio de la herida (WE) como una acumulación de progenitores indiferenciados y multilinaje que resultan de células de tejido maduro desdiferenciadas o células madre residentes. Las células de blastema proliferan y se diferencian en todos los tipos de células faltantes. Finalmente, tiene lugar la morfogénesis de las extremidades, donde el tejido esquelético se regenera a través de la condensación de condroprogenitores derivados de células periskeletales y fibroblastos dérmicos transdiferenciados 13,14,15.
Aunque se han identificado muchas de las señales bioquímicas que regulan los cambios en la identidad celular y la composición de la MEC 10,13,14,16,17,18, las propiedades mecánicas de los tejidos durante las diferentes fases de la regeneración de las extremidades, así como su influencia en la regeneración, han permanecido en gran medida inexploradas. Muchos estudios han demostrado que las células detectan e integran señales mecánicas que regulan su destino y comportamiento en varios contextos (revisado en19,20). Por lo tanto, complementar nuestro conocimiento celular y molecular de la regeneración de extremidades con mediciones mecánicas de tejidos mejorará en gran medida nuestra comprensión de estos procesos.
Se han desarrollado diferentes técnicas que permiten la caracterización mecánica y la manipulación forzada de muestras biológicas21. Entre estas técnicas, la microscopía de fuerza atómica (AFM) se ha convertido en el estándar de oro en mecanobiología, en la que las propiedades viscoelásticas de las muestras biológicas se sondean a alta resolución espacial mediante indentación con un sensor de fuerza ultrasensible, el AFM cantilever22. Dado que esta técnica requiere contacto directo con la muestra, por lo general, se generan cortes de tejido, lo que puede ser un desafío en algunos casos. Por lo tanto, las condiciones de preparación deben adaptarse y optimizarse para cada muestra en particular, de modo que pueda permanecer lo más cerca posible de las condiciones fisiológicas y se generen artefactos mínimos23. Este protocolo describe cómo medir la rigidez del tejido en las extremidades de los ajolotes utilizando AFM, centrándose en los tejidos cartilaginosos en condiciones intactas, mientras se someten a histólisis y en las etapas de condensación del cartílago (Figura 1 y Figura 2). Este método también puede ampliarse para la medición de otros tipos de tejidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, demostramos una técnica para la medición de la rigidez del cartílago en extremidades de ajolote con AFM. Sin embargo, este método también puede ampliarse para sondear otros tipos de tejidos. Un paso clave para el éxito de las mediciones de AFM es la preparación de la muestra, que resultó ser especialmente difícil con las muestras de ajolotes. Descubrimos que sondear la superficie del tejido que aún estaba incrustada en el bloque de agarosa era la mejor manera de preserva…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos los miembros del laboratorio Sandoval-Guzmán por su continuo apoyo y compañerismo durante el desarrollo de este trabajo. También agradecemos a Anja Wagner, Beate Gruhl y Judith Konantz por su dedicación al cuidado del ajolote. También agradecemos a Paul Müller por proporcionar códigos para el análisis de datos de AFM. Este trabajo contó con el apoyo de la Instalación de Microscopía Óptica de la Plataforma Tecnológica CMCB de la Universidad Técnica de Dresde. AT es miembro del Mildred Scheel Early Career Center Dresden P2, financiado por la Ayuda Alemana contra el Cáncer (Deutsche Krebshilfe). RA está financiada por un puesto temporal de PI (Eigene Stelle) de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) – AI 214/1-1.
Materials
| Affinity Designer | Affinity | version 1.10.4 | For figure assembling |
| Agarose Low Melt | Roth | 6351.1 | For sample preparation |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | To stain tissue |
| Axiozoom | Zeiss | To image samplea under the AFM | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | To anesthetize the animals |
| Butorphanol (+)-tartrate salt | Sigma-Aldrich | B9156 | As analgesic |
| Cantilever | NanoWorld | Arrow TL1 | For AFM indentation measurements |
| Cellhesion 200 setup equipped with a motorstage | JPK/Bruker | For AFM indentation measurements | |
| CellSense Entry | For imaging in Stereoscope Olympus UC90 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS, 1x) | Gibco | 14190-144 | To clean samples and section under vibratome |
| FIJI (ImageJ2) | https://imagej.net/software/fiji | version 2.9.0/1.53t | For image processing |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | (version 8.4.3) | To graph and statistically analyze the data |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10270-106 | For cell culture medium |
| Histoacryl glue (2-Butyl-Cyanoacrylate) | Braun | To glue sample to petri dishes | |
| Hoechst 33258 | Abcam | ab228550 | To stain tissue |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I5500 | For cell culture medium |
| Inverted confocal microscope | Zeiss | 780 LSM | To image tissue sections |
| Inverted confocal microscope | Zeiss | 980 LSM | To image tissue sections |
| JPK/Bruker data processing software | JPK/Bruker | SPM 6.4 | To analyze force-distance curves |
| L15 medium (Leibovitz) | Sigma | L1518 | For cell culture medium |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | For cell culture medium |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | For cell culture medium |
| polystyrene beads ( 20 µm diameter); ) | microParticles | For AFM indentation measurements | |
| Pyjibe | written by Paul Müller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe | 0.15.0 | For viscoelastic analysis |
| Stereoscope Olympus SX10 | Olympus | SX10 | For limb amputations and tissue mounting |
| Stereoscope Olympus UC90 | Olympus | UC90 | For imaging |
| Vibratome Leica | Leica | VT 1200S | For tissue sectioning |
Referencias
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