ミニブタにおける単一段階組織工学尿路上皮管の手術モデル

この実験は、動物被験者の実験室での使用に関するヨーロッパの法律に従い、デンマーク食糧農業省から倫理的な許可を得た上で、AAALAC認定の実験施設で行われました(参照番号2022-15-0201-01206)。 1.外科的処置 動物の調理法成長したメスのゲッティンゲンミニブタを術前に少なくとも12時間速くします。 以下に説明するように、すべての滅菌器具で手術台を準備します。 完全に成長した標準サイズのミニブタの場合、1.25 mLのケタミン(100 mg / mL)、6.25 mLのキシラジン(20 mg / mL)、1.25 mLのメタドン(10 mg / mL)および2 mLのブトルファノール(10 mg / mL)(後に鎮静混合物と呼ばれる)に懸濁した125 mgのゾラゼパムと125 mgのタイルタミンの溶液を含む1.0〜1.4 mL / 10 kgの筋肉内注射により動物を鎮静します。. 視覚ガイド付き気管内挿管を行います。バイタルサインと眼および指間反射テストによって麻酔を確認します。眼科用軟膏を両側に塗布します。. 両側耳静脈カテーテルを装着し、プロポフォール(10-15 mg / kg / h)とフェンタニル(5-15 mg / kg / h)で麻酔を維持します。 8 Fr 尿道カテーテルを挿入し、適切なサイズのルアー ロック シリンジを使用して、250 mL の生理学的に温暖な等張生理食塩水で膀胱を満たします。 豚を仰臥位にしてから、腹部を壊してこすります。70%エタノールでさらに2回の皮膚洗浄を行った後、滅菌ドレープで手術野を囲みます。 組織採取と外科用足場の移植メスと焼灼を使用して標準的な下部正中線開腹術を行い、皮膚、筋肉、腹膜を分割し、腹腔内膀胱を傷口に引き寄せます。 膀胱前壁で予防的止血を行い、2 cm2 の全壁セグメントを切除し、近位開口部を1 cm2 のままにし、残りの膀胱壁を速吸収性の編組ランニング縫合糸で閉じます。 切除した標本の粘膜層を慎重に解剖し、2 cm2 の粘膜標本を1 mm2 のマイクログラフトに細かく刻んで足場を埋め込みます(以下のセクション2で説明します)。 足場が完成したら、ゆっくりと吸収されるモノフィラメントランニング縫合糸を使用して、管状構造物を膀胱前壁の残りの開口部に吻合します。 恥骨靭帯から腹膜フラップを使用して管状足場にパッチを当て、管腔内14 Fr順行性結腸浣腸(ACE)ストッパーを管状足場に配置します。. 尿の漏れを防ぐために、導管の遠位端をゆっくりと吸収可能な4-0モノフィラメント縫合糸で結紮し、膀胱カテーテルを介してシリンジで合計250mLの滅菌生理食塩水を注入して、吻合部の開存性を確認します。 正中線に対して横方向、右側の尾側乳腺に対して2〜3 cmの尾側に経筋膜チャネルを鈍く解剖し、導管を皮下ポケットに入れます。.遠位導管を2つの経皮的非吸収性モノフィラメント縫合糸で固定し、皮膚レベルでの位置をマークします。 腹部筋の前筋筋膜をゆっくりと吸収性モノフィラメントランニング縫合糸で閉じ、皮下筋を速吸収性編組ランニング縫合糸で適応させ、非吸収性モノフィラメントランニング縫合糸で皮膚を閉じます。 麻酔を中止した後、動物を抜管し、完全に歩行可能になり、安全に飲んだり食べたりできるようになるまで、厩舎で観察します。 2.足場工事 複合足場の準備手術前(最大2時間)に、前述のようにラットテールコラーゲンI型の液体溶液を調製します17。簡単に言うと、コラーゲン溶液に10倍の最小必須培地(MEM)を4:1で加え、1M NaOHでpHを7.4に近づけ、最後に1倍のMEMを添加して、最終的なコラーゲン濃度を1.64 mg/mLを目指します。溶液は、さらに使用するまで氷上の滅菌バイアルに保管してください。 外科的組織切除およびミンチ後、粘膜粒子(すなわち、マイクログラフト)を1:6の拡張速度で2 cm x 6 cmの適合生分解性メッシュに手動で配置します(たとえば、2 cm2 の粘膜組織を12 cm2 メッシュに拡張します)鉗子を使用して。 滅菌鋼板の上に1cm×3cm×6cm(高さ×幅×長さ)の滅菌長方形鋼型を用意し、マイクログラフトを上に向けてメッシュを鋼型に入れます。20mLのコラーゲン溶液を型にそっと流し込み、マイクログラフトがメッシュから洗い流されないようにします。コンストラクト全体を38°Cの滅菌加熱チャンバーに移し、5分間固化させます。 十分に固化した後、穴あき鋼板の上に置かれたナイロンメッシュにハイドロゲルをスライドさせ、金型を静かに取り出します。 ゲルの上にナイロンメッシュを敷き、次に鋼板を載せてハイドロゲルから水分を排出し、鋼板の上に120gの重り(この場合は埋込みに用いた鋼製金型に相当)を鋼板の上に5分間置いて受動的に圧縮します。 圧縮後、平らにした足場を生分解性ステントの周りで転がし、ステントに面したマイクログラフトを5 cm x 0.6 cm(長さx内径)の大きさにし、低吸収性のモノフィラメントランニング縫合糸で足場を縦方向に縫合します。完成した導管は、外科的移植の準備が整いました。 3. 術後管理 鎮痛と抗生物質の予防ブプレノルフィン(0.05-0.1 mg / kg / 8時間静脈内)、最初の4日間はメロキシカム(0.4 mg / kg /日の筋肉内または経口)、トリメトプリム(2.7 mg / kg /日の筋肉内または経口4.2 mg / kg /日)とスルファドキシン(13.3 mg / kg /日の筋肉内または20.8 mg / kg /日の経口)を最初の5日間投与します。.動物がまだ麻酔をかけられている間に、術後に筋肉内注射を投与します。 動物をシングルハウスにして、外部静脈カテーテルや縫合糸材料をかじらないようにします。プレキシガラスの窓を通して隣接するミニブタとの視覚的な接触と、ペン間の鼻の接触の可能性を提供します。毎日新鮮なわらや干し草、おもちゃや 水を自由に供給 し、毎日2回給餌します。 自然な行動、食習慣、尿や便の産生について動物を毎日監視し、毎週体重を評価します。 観察期間の終わり(6週間)に、鎮静混合物の1〜1.4 mL / 10 kg筋肉内注射で動物を鎮静させ、致死性のペントバルビタール注射(静脈内100 mg / kg)で動物を終了します。. 4. 事後分析評価 肉眼的な解剖学終了後、遠位導管を皮膚レベルで解剖し、ACEストッパーを取り外します。.プラスチック製のクランプで尿道を閉じ、カテーテルを使用して遠位導管開口部を介して等張生理食塩水にイオヘキソールの1:20造影剤溶液250mLを注入します。. 64スライスのコンピューター断層撮影スキャナーで動物を評価します。多平面再構成を使用して画像を視覚化し、医用画像処理ソフトウェアを使用してすべての画像を分析します。 天然尿道を介して16.2Frの柔軟な膀胱鏡を使用して、膀胱と導管腔の内視鏡検査を行います。 導管を一括して切除し、肉眼的な解剖学的所見を慎重に評価します。さらに、導管吻合に対して 2 cm のマージンで全壁膀胱生検を切除し、参照値についても同様の方法で処理します。 組織学的処理切除した標本を10%ホルマリンで24時間固定します。 メスで直交するコンジットを、近位、内側、および遠位のコンジットセグメントの同じサイズの別々のセクションに分割します。エタノール濃度を上げて試料を脱水し、ミクロトーム切片化の前にパラフィンに埋め込みます。 5 μm切片をヘマトキシリンとエオシン(H&E)およびパンサイトケラチンCK-AEで染色し、デジタル組織学スライドスキャナーでスキャンします。