Un enfoque para la construcción de comunidades de biopelículas multiespecies a partir del suelo de la rizosfera
Summary
Aquí se presenta un procedimiento rápido y estandarizado para establecer comunidades sinérgicas de biopelículas multiespecie de varios suelos de rizosfera. Se trata de un protocolo único diseñado para sondear y simular la compleja rizosfera de la microbiota del suelo.
Abstract
La biopelícula multiespecie es un estilo de vida natural y dominante de las bacterias en la naturaleza, incluso en el suelo de la rizosfera, aunque su comprensión actual es limitada. Aquí, proporcionamos un enfoque para establecer rápidamente comunidades sinérgicas de biopelículas multiespecies. El primer paso es extraer células del suelo de la rizosfera utilizando el método de centrifugación diferencial. Posteriormente, estas células del suelo se inoculan en el medio de cultivo para formar una biopelícula películo. Después de 36 h de incubación, la composición bacteriana de la biopelícula y la solución subyacente se determinan utilizando el método de secuenciación de amplicones del gen ARNr 16S. Mientras tanto, el aislamiento bacteriano de alto rendimiento de la biopelícula de la película se lleva a cabo utilizando el método de dilución limitante. A continuación, se seleccionan los 5 taxones bacterianos principales con la mayor abundancia en los datos de secuenciación de amplicones del gen 16S rRNA (muestras de biopelícula películo) para su posterior uso en la construcción de comunidades de biopelículas multiespecie. Todas las combinaciones de los 5 taxones bacterianos se establecieron rápidamente utilizando una placa de 24 pocillos, seleccionadas por la mayor capacidad de formación de biopelículas mediante el ensayo de tinción de violeta cristalino y cuantificadas por qPCR. Finalmente, las comunidades de biopelículas bacterianas sintéticas multiespecie más robustas se obtuvieron a través de los métodos anteriores. Esta metodología proporciona orientación informativa para la realización de investigaciones sobre la biopelícula multiespecie de la rizosfera y la identificación de comunidades representativas para estudiar los principios que rigen las interacciones entre estas especies.
Introduction
Las biopelículas representan comunidades microbianas intrincadas, ya sea adheridas a superficies o unidas con interfaces. Existe un amplio reconocimiento de que la mayoría de las bacterias que se encuentran en diversos entornos, como hábitats naturales, entornos clínicos y contextos industriales, perduran dentro de las comunidades de biopelículas1. En el suelo, la rizosfera, que abarca la superficie de la raíz y su región adyacente de 2 mm de espesor, forma un nicho ecológico con una mayor disponibilidad de nutrientes. Bacterias específicas han desarrollado estrategias para explotar este nicho, fomentando la proliferación microbiana y fomentando la formación de comunidades de biopelículas en la rizosfera2.
Los microbios de la rizosfera se consideran el “segundo genoma” de las plantas3. Los microorganismos promotores del crecimiento vegetal (PGPM) participan en simbiosis mutualista con las plantas, proporcionando importantes funciones de promoción del crecimiento y biocontrol4. Por un lado, el PGPM puede suministrar nutrientes a las raíces de las plantas, mejorar la absorción de nutrientes, defenderse contra patógenos y degradar contaminantes en el suelo de la rizosfera5. Por otro lado, el PGPM utiliza los exudados de las raíces de las plantas como fuente de nutrientes para el crecimiento y la evolución, influyendo así en el suelo de la rizosfera y el sistema radicular a través de su propio metabolismo. Vale la pena señalar que el requisito previo para todas estas funciones es la colonización efectiva de PGPM en la rizosfera de la planta, formando biopelículas estables6.
La biopelícula de la rizosfera afecta el proceso de ensamblaje de los microbios de la rizosfera, y las características temporales y espaciales del ensamblaje de los microbios de la rizosfera están estrechamente relacionadas con la interacción de la biopelícula multiespecie7. Sirve como centro de interacciones planta-microbioma, proporcionando un nicho estable y controlable para que interactúen de manera efectiva. Por lo tanto, el estudio de la biopelícula de la rizosfera también es una dirección importante para obtener información sobre la interacción entre las plantas y los microbios.
Sin embargo, en la actualidad hay poca investigación sobre las biopelículas multiespecie de la rizosfera. La alta complejidad de la composición del microbioma hace que sea difícil responder a las preguntas ecológicas fundamentales que rodean a las comunidades microbianas naturales8. En el proceso de los experimentos, es necesario tener en cuenta muchas condiciones, como el tipo de suelo, el tipo de planta y el gran número de comunidades microbianas. Diversos factores limitan la investigación de las biopelículas multiespecie de la rizosfera.
Para investigar más a fondo las comunidades de biopelículas multiespecie del suelo de la rizosfera, como las interacciones sinérgicas entre especies o la alimentación cruzada de metabolitos8, es deseable construir artificialmente una comunidad microbiana sintética simplificada, representativa, estable y manejable en condiciones de laboratorio 9,10. Aquí, un protocolo estandarizado combina varias de las últimas técnicas microbiológicas y bioinformáticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Siguiendo el protocolo, se construyen una serie de comunidades robustas de biofilm sintético multiespecie a partir de la microbiota en suelos de rizosfera de diferentes plantas. Mediante técnicas cuantitativas de PCR se descifra claramente la composición de cada comunidad. La biomasa de la biopelícula indica la fuerza de sus posibles interacciones metabólicas, aunque no se pudieron revelar aquí varias propiedades y mecanismos detrás de la cooperación19. Dado el tamaño y la complejidad de …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (42307173 y 42107328) y el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave (2022YFD1500202 y 2022YFF1001800). P.W, Z.X diseñó el estudio. P.W, B.X, Z.C, J.X y N.Z analizaron los datos y crearon las cifras. P.W escribió el primer borrador del manuscrito. Z.X., R.Z. y Q.S. revisaron el manuscrito.
Materials
| 0.2 % Na4P2O7 solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 20041418 | Used to dilute the soil suspension. |
| 100 μm Nylon Cell Filter | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | F613463-0001 | Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm. |
| 2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | L03336903 | Used to sterilize the seeds. |
| 24-well Plate | Merck & Co., Inc. | PSRP010 | Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation. |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) | Bioolook Scientific Research Special | 2360010 | Used to prepare MSgg media. |
| 50 mL Centrifuge Tube | Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd. | 62.547.254 | Properly-sized centrifuge tubes for our protocol. |
| 75% C2H5OH solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 801769680 | Used to sterilize the seeds. |
| Acinetobacter baumannii XL-1 | Nanjing Agricultural University | N/A | Strains isolated from rhizosphere soil. |
| Bacillus velezensis SQR9 | Nanjing Agricultural University | N/A | Strains isolated from rhizosphere soil. |
| Bacteria DNA Kit | Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd. | D3350020000K04U021 | Used to extract bacterial DNA. |
| Black Soil I | Nanjing Agricultural University | N/A | Black soil from Jilin Province. |
| Black Soil II | Nanjing Agricultural University | N/A | Black soil from Heilongjiang Province. |
| Burkholderia cenocepacia XL-2 | Nanjing Agricultural University | N/A | Strains isolated from rhizosphere soil. |
| CaCl2 | Xilong Scientific Co.,Ltd. | 10035048 | Used to prepare MSgg media. |
| Centrifuge | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | G508009-0001 | High-speed centrifuge. |
| ChamQ SYBR qPCR Master Mix | Vazyme Biotech Co.,Ltd. | Q311-02 | Used for DNA amplification in qPCR. |
| Clean Bench | Suzhou Antai Airtech Co., Ltd. | NB026143 | Used for aseptic operation. |
| Constant Temperature Incubator | ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd | GNP-9080BS- |
Used for microbial cultivation. |
| Cristal Violet Dye | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | A600331 | Used for pellicle biofilm staining and quantifivation. |
| Cucumber Seed | Nanjing Agricultural University | N/A | "Jinchun I" cucumber seed. |
| Culturome v 1.0 | The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification |
| FeCl3 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011918 | Used to prepare MSgg media. |
| Fridge | Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd. | BCD-556WKPM(Q) | Used for strain preservation. |
| Glutamate | Bioolook Scientific Research Special | 2180020 | Used to prepare MSgg media. |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010618 | Used to prepare MSgg media. |
| Hydroponic Planting Basket | Yulv Furniture Store | 6526262626 | Used for cucumber hydroponics. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co.,Ltd. | 10017618 | Used to prepare MSgg media. |
| MgCl2 | Xilong Scientific Co.,Ltd. | 7791186 | Used to prepare MSgg media. |
| MnCl2 | Xilong Scientific Co.,Ltd. | 10400101 | Used to prepare MSgg media. |
| Msgg Medium | Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd. | BES20791KB | Pellicle biofilm culture medium. |
| Na2HPO4·7H2O | Merck & Co., Inc. | S9390-100G | Used to prepare TSB media. |
| NaCI | Chinasun Specialty Products co., Ltd. | HS0416 | Used to prepare TSB media. |
| NaH2PO4·H2O | Merck & Co., Inc. | S9638-25G | Used to prepare TSB media. |
| PBS-S Buffer | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | E607008-0001 | Basic buffer for living tissues. |
| Phenylalanine | RYON | RT3486L005 | Used to prepare MSgg media. |
| Pipette | Beijing Labgic Technology Co.,Ltd. | BS-1000-T | Used for strain inoculation. |
| PMD19T Plasmid | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd. | D102A | Used to generate qPCR standard curves. |
| Pot | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | YHHWS2401 | Used for cucumber soil culture. |
| Primer for qPCR | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | N/A | Used for DNA amplification in qPCR. |
| Real-Time PCR Instrument | Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd. | 4484073 | Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm. |
| Roary | The Wellcome Trust SangerInstitute | N/A | Used to design primers of qPCR |
| Shaker | Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd | ZQTY-50S | Used for solution mixing and microbial cultivation. |
| Silwet L-77 | Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd. | SL77080596 | Used to prepare TSB media. |
| Soy peptone | Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd | HB8275 | Used to prepare TSB media. |
| Spectrophotometer | Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd. | 76713100010 | Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation. |
| Sterile Water | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | SW150302 | Used to wash the pellicle biofilm. |
| Sterilized Nitrile Gloves | Beijing Labgic Technology Co.,Ltd. | 223016852LLZA | Used for basic experimental operations. |
| Template DNA | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | N/A | Used for DNA amplification in qPCR. |
| Thiamine | Bioolook Scientific Research Special | 2180020 | Used to prepare MSgg media. |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0042B | Used to prepare TSB media. |
| Tryptophan | Bioolook Scientific Research Special | 2190020 | Used to prepare MSgg media. |
| TSB Medium | Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd. | 024048 | Broad-spectrum bacterial medium. |
| TSB-Msgg Meidium | Nanjing Agricultural University | N/A | Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability. |
| ZnCl2 | Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd | C0310520123 | Used to prepare MSgg media. |
Referencias
- Davey, M. E., O’Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).
- Campbell, R., Greaves, M. P., Lynch, J. Anatomy and community structure of the rhizosphere. Rhizosphere. , 11-34 (1990).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M., Bakker, P. A. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends Plant Sci. 17 (8), 478-486 (2012).
- Lugtenberg, B., Kamilova, F. D. Plant-growth-promoting rhizobacteria. Annu Rev Microbiol. 63, 541-556 (2009).
- Compant, S., Clément, C., Sessitsch, A. Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants: Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization. Soil Biol Biochem. 42, 669-678 (2010).
- Bais, H. P., Fall, R. R., Vivanco, J. M. Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production. Plant Physiol. 134 (1), 307-319 (2004).
- Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health. Nat Rev Microbiol. 18, 607-621 (2020).
- Sun, X., et al. Bacillus velezensis stimulates resident rhizosphere Pseudomonas stutzeri for plant health through metabolic interactions. ISME J. 16, 774-787 (2021).
- Pandhal, J., Noirel, J. Synthetic microbial ecosystems for biotechnology. Biotechnol Lett. 36, 1141-1151 (2014).
- Grosskopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Curr Opin Microbiol. 18, 72-77 (2014).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana. root microbiome. Nature. 488, 86-90 (2012).
- Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528, 364-369 (2015).
- Bakken, L. R. Separation and purification of bacteria from soil. Appl Environ Microbiol. 49 (6), 1482-1487 (1985).
- Yang, O., et al. Direct cell extraction from fresh and stored soil samples: Impact on microbial viability and community compositions. Soil Biol Biochem. 155, 108178 (2021).
- Ren, D., et al. High-throughput screening of multispecies biofilm formation and quantitative PCR-based assessment of individual species proportions, useful for exploring interspecific bacterial interactions. Microb Ecol. 68, 146-154 (2013).
- Sun, X., et al. Metabolic interactions affect the biomass of synthetic bacterial biofilm communities. mSystems. 8, e01045-e01123 (2023).
- Zhang, J., et al. High-throughput cultivation and identification of bacteria from the plant root microbiota. Nat Protoc. 16, 988-1012 (2021).
- Ren, D., Madsen, J. S., Sørensen, S. J., Burnolle, M. High prevalence of biofilm synergy among bacterial soil isolates in cocultures indicates bacterial interspecific cooperation. ISME J. 9, 81-89 (2015).
- Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48 (1), 066 (2024).
- Palková, Z. Multicellular microorganisms: Laboratory versus nature. EMBO Rep. 5, 470-476 (2004).
- Xu, Z., et al. Chemical communication in plant-microbe beneficial interactions: a toolbox for precise management of beneficial microbes. Curr Opin Microbiol. 72, 102269 (2023).
