Упрощенный метод выделения и культивирования клеток пигментного эпителия сетчатки у взрослых мышей
Summary
Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) действует как важнейший барьер между сосудистой оболочкой и сетчаткой, способствуя здоровью и функции типов клеток сетчатки, таких как фоторецепторы. В данной работе мы описываем простой и эффективный протокол выделения и культивирования взрослых мышей RPE.
Abstract
Пигментные эпителиальные клетки сетчатки (РПЭ) имеют решающее значение для правильного функционирования сетчатки. Дисфункция РПЭ участвует в патогенезе важных заболеваний сетчатки, таких как возрастная макулярная дегенерация, пигментный ретинит и диабетическая ретинопатия. Мы представляем оптимизированный подход к выделению РПЭ из глаз взрослых мышей. В отличие от ранее описанных методов, этот подход позволяет выделить и культивировать высокочистый РПЭ от взрослых мышей. Этот простой и быстрый метод не требует обширных технических навыков и достижим с помощью основных научных инструментов и реактивов. Первичные РПЭ выделяют у фоновых мышей C57BL/6 в возрасте от 3 до 14 недель путем энуклеации глаза с последующим удалением переднего сегмента. Ферментативная трипсинизация и центрифугирование используются для диссоциации и изоляции РПЭ от наглазника. В заключение следует отметить, что этот подход предлагает быстрый и эффективный протокол использования РПЭ в изучении функции и заболеваний сетчатки.
Introduction
Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) представляет собой специализированный клеточный монослой, выстилающий мембрану Бруха, расположенный между фоторецепторами и сосудистой оболочкой1. Клетки РПЭ играют решающую роль в правильном функционировании сетчатки. Клетки РПЭ транспортируют глюкозу и витамин А к фоторецепторам, улучшают зрение путем повторной изомеризации полностью транс-ретиналь в 11-цис-сетчатку и поддерживают внешние сегменты фоторецептора посредством фагоцитоза отторгнутых наружных сегментов, удаляют воду из субретинального пространства, формируют внешний гематематический барьер за счет наличия плотных соединений и секретируют нейротропные факторы роста (такие как производный фактор пигментного эпителия). и основной фактор роста фибробластов), которые поддерживают фоторецепторы2. Дисфункция клеток РПЭ участвует в патогенезе различных ретинопатий, включая возрастную макулярную дегенерацию, пигментный ретинит и диабетическую ретинопатию 3,4,5. Исследования in vitro с использованием клеток РПЭ имеют решающее значение для улучшения нашего понимания патогенеза этих заболеваний. Первичные клетки РПЭ являются гораздо более предпочтительными для этих исследований, поскольку клеточные линии РПЭ, хотя и легкодоступны, не имеют ключевых характеристик первичных клеток РПЭ.
В то время как различные виды использовались в качестве источников первичных клеток РПЭ, у мышей есть преимущество использования генетических модификаций для понимания патогенеза ретинопатий. Ранее описанные протоколы выделения клеток РПЭ от грызунов либо требуют использования неонатальных животных, либо являются длительными, требуют технических навыков, либо не подходят для культивирования 6,7,8,9,10,11,12. Мы описываем простой и быстрый метод выделения клеток RPE от взрослых мышей, которые дают высокочистые культуры этих клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы изложили упрощенный протокол выделения и бактериологического исследования пигментного эпителия сетчатки мыши. Клетки RPE, выделенные из глаз взрослых мышей, экспрессировали RPE-специфичный маркер RPE65 и маркер межклеточного соединения ZO-1. Кроме того, культивируемые клет?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны NIH Grants R01EY018341 and R01EY019250 (C.S.S.), NIH Grant F31EY035156 (A.H.) и P30 EY011373. Финансирующая организация не играла никакой роли в планировании или проведении этого исследования.
Materials
| 0.009 RD Single-Edge Blades | Personna | 941202 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| GlutaMAX, 100x | Gibco | 35050061 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175095 | no Calcium, no magnesium, no phenol red |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100x | Gibco | 11140050 | |
| Micro-Unitome Knife | BVI Beaver | 377546 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Polystyrene Microplates | Falcon | 08-772-1 | 24-well or 48-well |
| Regular Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | with phenol red |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 10091-12 |
Referencias
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Prog Retin Eye Res. 100846, (2020).
- Lambros, M. L., Plafker, S. M. Oxidative stress and the Nrf2 anti-oxidant transcription factor in age-related macular degeneration. Adv Exp Med Biol. 854, 67-72 (2016).
- Ferrari, S., et al. Retinitis pigmentosa: genes and disease mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Xia, T., Rizzolo, L. J. Effects of diabetic retinopathy on the barrier functions of the retinal pigment epithelium. Vision Res. 139, 72-81 (2017).
- Edwards, R. B. Culture of rat retinal pigment epithelium. In Vitro. 13 (5), 301-304 (1977).
- Mayerson, P. L., Hall, M. O., Clark, V., Abrams, T. An improved method for isolation and culture of rat retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 26 (11), 1599-1609 (1985).
- Chang, C. W., Roque, R. S., Defoe, D. M., Caldwell, R. B. An improved method for isolation and culture of pigment epithelial cells from rat retina. Curr Eye Res. 10 (11), 1081-1086 (1991).
- Wang, N., Koutz, C. A., Anderson, R. E. A method for the isolation of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (1), 101-107 (1993).
- Sakagami, K., et al. A rapid method for isolation of retinal pigment epithelial cells from rat eyeballs. Ophthalmic Res. 27 (5), 262-267 (1995).
- Heller, J. P., Kwok, J. C., Vecino, E., Martin, K. R., Fawcett, J. W. A method for the isolation and culture of adult rat retinal pigment epithelial (RPE) cells to study retinal diseases. Front Cell Neurosci. 9, 449 (2015).
- Shen, J., He, J., Wang, F. Isolation and culture of primary mouse retinal pigment epithelial (RPE) cells with Rho-Kinase and TGFbetaR-1/ALK5 inhibitor. Med Sci Monit. 23, 6132-6136 (2017).
- Hood, E. M. S., Curcio, C., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protoc. 3 (4), 101758 (2022).
- Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight Junctions of the outer blood retina barrier. Int J Mol Sci. 21 (1), 211 (2019).
- Ban, B., Rizzolo, L. J. A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions. Mol Vis. 3, 18 (1997).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Yang, S., Zhou, J., Dengwen, L. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Front Pharmacol. 12, 727870 (2021).
