Aquí, presentamos un protocolo que incluye el rastreo mitocondrial, los procedimientos de cocultivo directo de células madre mesenquimales (MSC) y células epiteliales pigmentarias de la retina (ARPE19), así como los métodos para observar y analizar estadísticamente la formación de nanotubos de túnel (TNT) y la transferencia mitocondrial para caracterizar el intercambio mitocondrial a través de TNT entre MSC y células ARPE19.
La transferencia mitocondrial es un fenómeno fisiológico normal que ocurre ampliamente entre varios tipos de células. En el estudio hasta la fecha, la vía más importante para el transporte mitocondrial es a través de nanotubos de efecto túnel (TNT). Ha habido muchos estudios que informan que las células madre mesenquimales (MSC) pueden transferir mitocondrias a otras células mediante TNT. Sin embargo, pocos estudios han demostrado el fenómeno de la transferencia mitocondrial bidireccional. Aquí, nuestro protocolo describe un enfoque experimental para estudiar el fenómeno de la transferencia mitocondrial entre MSCs y células epiteliales pigmentarias de la retina in vitro mediante dos métodos de rastreo mitocondrial.
Co-cultivamos MSCs transfectadas con mito-GFP con células ARPE19 transfectadas con mito-RFP (una línea celular epitelial de pigmento de la retina) durante 24 h. A continuación, todas las células se tiñeron con faloidina y se obtuvieron imágenes mediante microscopía confocal. Observamos mitocondrias con fluorescencia verde en células ARPE19 y mitocondrias con fluorescencia roja en MSCs, lo que indica que la transferencia mitocondrial bidireccional ocurre entre MSCs y células ARPE19. Este fenómeno sugiere que el transporte mitocondrial es un fenómeno fisiológico normal que también ocurre entre las MSC y las células ARPE19, y la transferencia mitocondrial de las MSC a las células ARPE19 ocurre con mucha más frecuencia que viceversa. Nuestros resultados indican que las MSC pueden transferir mitocondrias al epitelio pigmentario de la retina y, de manera similar, predicen que las MSC pueden alcanzar su potencial terapéutico a través del transporte mitocondrial en el epitelio pigmentario de la retina en el futuro. Además, la transferencia mitocondrial de las células ARPE19 a las MSC aún no se ha explorado más a fondo.
Las mitocondrias sirven como la principal fuente de energía para la mayoría de los tipos de células, y la disfunción mitocondrial afecta particularmente a los tejidos que demandan alta energía, como laretina. Las alteraciones metabólicas en la retina pueden desencadenar una crisis bioenergética, que finalmente resulta en la muerte de los fotorreceptores y/o de las células EPR2. Las terapias basadas en células madre mesenquimales (MSC) han demostrado eficacia en el tratamiento de la degeneración ocular, y uno de los mecanismos precisos que subyacen a los efectos beneficiosos de las MSC en los tejidos de la retina puede atribuirse a la transferencia mitocondrial funcional 3,4,5,6. En 2004, Rustom et al. informaron por primera vez del fenómeno de la transferencia mitocondrial a través de una nueva interacción de célula a célula facilitada por nanotubos de efecto túnel (TNT)7.
En el cultivo 2D, los nanotubos de efecto túnel (TNT) se identifican por sus protuberancias de membrana delgadas (20-700 nm) que van desde decenas hasta cientos de nanómetros de longitud, que están suspendidas sobre el sustrato y pueden establecer conexiones directas entre dos o más células homotípicas y heterotípicas. Estas estructuras están notablemente enriquecidas en F-actina y facilitan el transporte de cargas, como las mitocondrias, entre las células. Además, los TNT poseen aberturas en ambos extremos, lo que permite la continuidad del contenido citoplasmático entre las células interconectadas8.
Es difícil detectar la transferencia mitocondrial mediada por TNT in vivo debido a la densa disposición celular y a los desafíos en el seguimiento de las mitocondrias. La experimentación in vitro, utilizando técnicas de cocultivo celular y rastreo mitocondrial, permite observar la formación de TNT y la transferencia mitocondrial 8,9. También observamos el fenómeno de la transferencia mitocondrial mediada por TNT mediante el cocultivo de MSCs y células epiteliales pigmentarias de la retina in vitro10.
Muchos estudios previos solo han observado la transferencia mitocondrial unidireccional de las MSC a otras células 3,4,5,6. Anteriormente, también intentamos analizar la transferencia mitocondrial bidireccional utilizando dos tipos de células marcadas con mito-tracker verde y mito-tracker rojo, respectivamente, pero la diafonía de los tintes interfirió con los resultados experimentales. Para estudiar con mayor precisión la transferencia bidireccional mitocondrial, aquí construimos dos líneas celulares con diferente fluorescencia mitocondrial utilizando la técnica de transfección lentiviral y, posteriormente, observamos y analizamos los fenómenos de formación de TNT y transferencia bidireccional mitocondrial por cocultivo directo in vitro.
En resumen, aquí se describe un protocolo paso a paso y accionable sobre cómo rastrear mitocondrias, cocultivar MSC con células ARPE19 y analizar la formación de TNT y la transferencia mitocondrial. Los resultados de este experimento demostraron la transferencia mitocondrial bidireccional mediada por TNT, que no solo demostró que el transporte mitocondrial es un fenómeno fisiológico común, sino que también mostró la capacidad terapéutica potencial de las MSC en las células de la retina.
Numerosos estudios han demostrado que el fenómeno de la transferencia mitocondrial mediada por TNT es un proceso fisiológico prevalente en varios tipos de células tisulares 10,11,12,13. La donación mitocondrial funcional de MSCs a células con disfunción mitocondrial exhibe un fuerte potencial terapéutico<sup class="xref…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Guangzhou CSR Biotech Co. Ltd por la obtención de imágenes con su microscopio comercial de superresolución (HIS-SIM), la adquisición de datos, la reconstrucción de imágenes SR, el análisis y la discusión. Este trabajo cuenta con el apoyo parcial de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82125007,92368206) y la Fundación de Ciencias Naturales de Pekín (Z200014).
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | |
6-well plate | NEST | 703001 | |
15 mL centrifuge tube | BD Falcon | 352097 | |
24-well plate | NEST | 702001 | |
ARPE19 cells | ATCC | CRL-2302 | Cell lines |
Bovine serum albumin (BSA) | Beyotime | ST025 | |
CellTrace violet | Invitrogen | C34557 | |
Cover slide | NEST | 801007 | |
DMSO | sigma | D2650 | |
DPBS | Gibco | C141905005BT | |
DMEM/F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | VivaCell | C04002-500 | |
FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
MSCs | Nuwacell | RC02003 | Cell lines |
ncMission | Shownin | RP02010 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
pCT-Mito-GFP | SBI | CYTO102-PA-1 | Plasmid; From https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv |
Puromycin | MCE | HY-B1743A | |
Pipette | Axygen | TF-1000-R-S | |
Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
Triton X-100 | Solarbio | T8200 | |
Transwell plate | Corning | 3470 |
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