Summary

Uso de un modelo aislado de corazón de rata funcional para probar estrategias de preservación del corazón de un donante

Published: October 04, 2024
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Summary

Describimos un protocolo de corazón de rata aislado ex vivo para probar estrategias de preservación del corazón de donantes. En este trabajo se describe el protocolo para su uso en el almacenamiento estático en frío de corazones de donantes de roedores; Sin embargo, el protocolo también se puede utilizar para corazones de donantes obtenidos después de la donación después de la muerte circulatoria y la muerte encefálica.

Abstract

La optimización de las soluciones de preservación del corazón de los donantes ha desempeñado un papel clave en la reducción de las lesiones por isquemia-reperfusión en los corazones de los donantes durante la extracción, el transporte y el trasplante de órganos. Trabajos previos de nuestro laboratorio demostraron que la adición de trinitrato de glicerilo y eritropoyetina a las soluciones de preservación cardíaca de donantes podría mejorar significativamente la recuperación funcional cardíaca después de un almacenamiento prolongado en frío y en la donación después de la muerte circulatoria de los corazones. Este protocolo de suplementación se ha implementado en uso clínico en unidades de trasplante de Australia, Bélgica y el Reino Unido. Aquí, describimos un protocolo para probar estrategias de suplementación utilizando un circuito de perfusión de corazón de rata de trabajo aislado ex vivo (IWRH). Con esta metodología, las estrategias de suplementación se pueden probar en el contexto del almacenamiento estático prolongado en frío, la donación después de la muerte encefálica y la donación después de la muerte circulatoria de la preservación del corazón del donante. La recuperación funcional cardíaca, medida por el flujo aórtico, el flujo coronario, el gasto cardíaco, la presión del pulso y la frecuencia cardíaca, se puede utilizar para determinar si una estrategia de preservación particular puede minimizar la lesión por isquemia-reperfusión del corazón del donante.

Introduction

El éxito de un trasplante de corazón puede verse influenciado en gran medida por el método de preservación utilizado para el corazón del donante. Los corazones de los donantes son sometidos a lesiones isquémicas durante todo el proceso de extracción, transporte y trasplante de órganos. El grado de daño isquémico en el órgano del donante puede mitigarse mediante la selección de una estrategia adecuada de preservación del corazón del donante. El almacenamiento estático en frío (CSS) sigue siendo el método más factible y común para la preservación del corazón del donante; sin embargo, es posible que CSS no sea necesariamente la mejor opción para todas las vías de donación de corazón. Por ejemplo, los corazones obtenidos a través de la vía de donación después de la muerte circulatoria (DCD) se mantienen y se evalúa su viabilidad utilizando la perfusión normotérmica en máquina, mientras que los corazones obtenidos a través de la vía de donación después de la muerte encefálica (DBD) se pueden preservar utilizando CSS o perfusión con máquina hipotérmica. Otro factor determinante importante para la estrategia de preservación utilizada es la cantidad de isquemia caliente (para la DCD) o isquemia fría (para la DBD) a la que se somete el corazón durante la obtención y el transporte del órgano.

Muchos centros utilizan suplementos farmacológicos adicionales de la solución de preservación cardíaca para aumentar la tolerancia isquémica y mejorar la función cardíaca después del trasplante. Los estudios en roedores de nuestro laboratorio demostraron que la suplementación de la cardioplejia con eritropoyetina y trinitrato de glicerilo fue capaz de mejorar significativamente la recuperación funcional cardíaca después de un almacenamiento prolongado en frío del corazón del donante 1,2. Estos estudios luego progresaron a estudios porcinos de preservación del corazón de donantes y proporcionaron la base preclínica que condujo a la incorporación de eritropoyetina y trinitrato de glicerilo en la solución de cardioplejia de corazones obtenidos a través de una vía DCD utilizando perfusión con máquina normotérmica 3,4,5. En la actualidad, la suplementación con eritropoyetina y trinitrato de glicerilo también se utiliza en las unidades de trasplante australianas para las recuperaciones cardíacas clínicas de DBD que incorporan CSS. El objetivo general del protocolo de perfusión de corazón de rata trabajador aislado (IWRH, por sus siglas en inglés) que se describe a continuación es probar las estrategias de preservación del corazón del donante en un entorno de laboratorio y probar su eficacia para preservar la función cardíaca del donante después de la reperfusión. El protocolo de corazón de rata de trabajo aislado descrito se ha utilizado durante más de dos décadas en nuestro laboratorio y ha demostrado ser extremadamente útil en la detección de posibles suplementos y/o estrategias que pueden mejorar la preservación del corazón del donante 2,7,8,9.

Protocol

Todos los animales recibieron atención humanitaria de acuerdo con las directrices del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (Australia). Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Instituto Garvan de Investigación Médica (Sydney, Australia). 1. Preparación del tampón Krebs-Henseleit (KH) Prepare 2 L de una solución madre 20x de tampón KH que contenga 2,36 M de NaCl, …

Representative Results

Los resultados de la perfusión basal determinarán si el experimento inicial (prealmacenamiento) fue exitoso. El flujo aórtico mostrado durante el modo de Langendorff debe estar entre 14 y 22 mL/min. El flujo de Langendorff se muestra como un valor negativo en el caudalímetro debido a la perfusión retrógrada de la aorta. En la Figura 4A se muestra un ejemplo de una traza de Langendorff aceptable. Una vez que se cambia al modo…

Discussion

Dada la naturaleza sensible de la función basal del corazón, se debe tener cuidado de mantener el equipo de perfusión limpio y con componentes compatibles. Por ejemplo, se debe utilizar el tubo de PVC correcto. Algunos materiales de los tubos, como la silicona, pueden contribuir a reducir el flujo aórtico y la contractilidad, lo que puede deberse a la pérdida de oxígeno a través del tubo. Si bien existen circuitos aislados de perfusión cardíaca de rata disponibles comercialmente…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los estudios descritos aquí han sido financiados por subvenciones otorgadas a P.S Macdonald por el Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia, la Fundación de la Clínica St Vincent y la Subvención de Investigador Senior de la Capacidad de Investigación Cardiovascular de NSW Health.

Materials

1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box Bio Strategy Pty Ltd 0030.125.150
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500 Sigma-aldrich Pty Ltd CLS430791-500ea
BP Transducer/Cable kit ADInstruments MLT1199 Data Acquisition
Bridge Amp ADInstruments FE221 Data Acquisition
Carbogen 555G2 BOC BOC002
Checktemp1 thermometer Hanna Instruments HI98509 Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12 Thomas Scientific 2848Y40 Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Med. Thomas Scientific 8847T08 Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Sm. Thomas Scientific 8847T02 Rig Construction
Clips, Vessel, 60 g Pressure Coherent Scientific 14121 Surgical Equipment
Closed Connector Thomas Scientific 8847E25 Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24 Specialist Medical Supplies S195 Surgical consumables
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser Custom Blown Glassware Pty Ltd N/A Rig Construction
Custom Made 750 mL Reservoir Custom Blown Glassware Pty Ltd N/A Rig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra Sigma-aldrich Pty Ltd G7528-1Kg To make Krebs Buffer
Dual Channel Console ADInstruments TS402 Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L 
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100 Bio-strategy Pty Ltd 1822047
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD Coherent Scientific 14114 Surgical Equipment
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated Met-App Australia Pty Ltd 1352 Rig Construction
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts) Thermoline Scientific TU3 Rig Construction
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115 Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd 1258693 Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL Cenvet Australia Pty Ltd X5010 Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog Clamp Coherent Scientific  CS-WPI-14117
Ketamine 100 mg/50 mL Provet (NSW) Pty Ltd KETAI1 Anaesthetic
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply Bio Strategy Pty Ltd MA048-500g To make Krebs Buffer
Male/Female Hinged Adapter Thomas Scientific 8847V08 Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor John Morris 1015164 Rig Construction
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved Coherent Scientific WPI-501748 Surgical Equipment
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight Coherent Scientific WPI-501252 Surgical Equipment
Mounting Hardware F/2-HEADS SS John Morris 1014414 Mounting screws for pump heads
Open-sided connector Thomas Scientific 8847E05 Rig Construction
Paraformadehyde Sigma-Aldrich P6148-500G Sample processing
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g VWR Chemicals  26764.26 To make Krebs Buffer
Potassium phosphate monobasic  Sigma-Aldrich Pty Ltd P5379-500g To make Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software ADInstruments ML826 Computer Hardware and Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF ADInstruments ME4PXN Rig Construction
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10 BSN Medical (Aust) Pty Ltd 73252-36
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK Merck Millipore SX0004701 Rig Construction
Silicone O-Ring 5-329 10/PK Merck Millipore XX1104707 Rig Construction
Single Buret Clamp Thomas Scientific 8847T32 Rig Construction
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler) Sigma-aldrich 59277 Rig Construction
Sm. 360 Rotation Connector Thomas Scientific 8847E35 Rig Construction
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Pty Ltd S6297 – 250g To make Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mm Merck Millipore SX0004700 Rig Construction
syringes 1 mL box/100 Becton Dickinson Pty Ltd 302100
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm Met-App Australia Pty Ltd 1356 Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410 ADInstruments TS410 Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC Thermo Fisher NAL 8701-0600 Rig Construction
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC Thermo Fisher NAL 8701-0900 Rig Construction
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll Thermo Fisher NAL 8701-4120 Rig Construction
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades Coherent Scientific WPI-500-086 Surgical Equipment
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray Thermoline Scientific TLWB-30 Rig Construction

Referencias

  1. Kwan, J. C., Gao, L., Macdonald, P. S., Hicks, M. Cardio-protective signalling by glyceryl trinitrate and cariporide in a model of donor heart preservation. Heart Lung Circ. 24 (3), 306-318 (2015).
  2. Watson, A. J., et al. Enhanced preservation of the rat heart after prolonged hypothermic ischemia with erythropoietin-supplemented Celsior solution. J Heart Lung Transplant. 32 (6), 633-640 (2013).
  3. Chew, H. C., et al. Outcomes of donation after circulatory death heart transplantation in Australia. J Am Coll Cardiol. 73 (12), 1447-1459 (2019).
  4. Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. Lancet. 385 (9987), 2585-2591 (2015).
  5. Joshi, Y., et al. Heart transplantation from DCD donors in Australia: Lessons learned from the first 74 cases. Transplantation. 107 (2), 361-371 (2023).
  6. Villanueva, J. E., et al. Functional recovery after dantrolene-supplementation of cold stored hearts using an ex vivo isolated working rat heart model. PLoS One. 13 (10), e205850 (2018).
  7. Villanueva, J. E., et al. The cardioprotective potential of the sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor empagliflozin in donor heart preservation. J Heart Lung Transplant. 39 (10), 1151-1153 (2020).
  8. Gao, L., et al. Critical role of the STAT3 pathway in the cardioprotective efficacy of zoniporide in a model of myocardial preservation – the rat isolated working heart. Br J Pharmacol. 162 (3), 633-647 (2011).
  9. Cropper, J. R., Hicks, M., Ryan, J. B., Macdonald, P. S. Cardioprotection by cariporide after prolonged hypothermic storage of the isolated working rat heart. J Heart Lung Transplant. 22 (8), 929-936 (2003).
  10. Gao, L., et al. Enhanced functional recovery of the heart donated after circulatory death determination with antemortem heparin. J Heart Lung Transplant. 39 (6), 607-609 (2020).
  11. Villanueva, J. E., et al. The effect of increasing donor age on myocardial ischemic tolerance in a rodent model of donation after circulatory death. Transplant Direct. 7 (6), e699 (2021).
  12. Kumarasinghe, G., et al. Improved heart function from older donors using pharmacologic conditioning strategies. J Heart Lung Transplant. 35 (5), 636-646 (2016).

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Villanueva, J. E., Gao, L., Dutta, S., Doyle, A., Joshi, Y., Macdonald, P. S. Using an Isolated Working Rat Heart Model to Test Donor Heart Preservation Strategies. J. Vis. Exp. (212), e66910, doi:10.3791/66910 (2024).

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