Describimos un protocolo de corazón de rata aislado ex vivo para probar estrategias de preservación del corazón de donantes. En este trabajo se describe el protocolo para su uso en el almacenamiento estático en frío de corazones de donantes de roedores; Sin embargo, el protocolo también se puede utilizar para corazones de donantes obtenidos después de la donación después de la muerte circulatoria y la muerte encefálica.
La optimización de las soluciones de preservación del corazón de los donantes ha desempeñado un papel clave en la reducción de las lesiones por isquemia-reperfusión en los corazones de los donantes durante la extracción, el transporte y el trasplante de órganos. Trabajos previos de nuestro laboratorio demostraron que la adición de trinitrato de glicerilo y eritropoyetina a las soluciones de preservación cardíaca de donantes podría mejorar significativamente la recuperación funcional cardíaca después de un almacenamiento prolongado en frío y en la donación después de la muerte circulatoria de los corazones. Este protocolo de suplementación se ha implementado en uso clínico en unidades de trasplante de Australia, Bélgica y el Reino Unido. Aquí, describimos un protocolo para probar estrategias de suplementación utilizando un circuito de perfusión de corazón de rata de trabajo aislado ex vivo (IWRH). Con esta metodología, las estrategias de suplementación se pueden probar en el contexto del almacenamiento estático prolongado en frío, la donación después de la muerte encefálica y la donación después de la muerte circulatoria de la preservación del corazón del donante. La recuperación funcional cardíaca, medida por el flujo aórtico, el flujo coronario, el gasto cardíaco, la presión del pulso y la frecuencia cardíaca, se puede utilizar para determinar si una estrategia de preservación particular puede minimizar la lesión por isquemia-reperfusión del corazón del donante.
El éxito de un trasplante de corazón puede verse influenciado en gran medida por el método de preservación utilizado para el corazón del donante. Los corazones de los donantes son sometidos a lesiones isquémicas durante todo el proceso de extracción, transporte y trasplante de órganos. El grado de daño isquémico en el órgano del donante puede mitigarse mediante la selección de una estrategia adecuada de preservación del corazón del donante. El almacenamiento estático en frío (CSS) sigue siendo el método más factible y común para la preservación del corazón del donante; sin embargo, es posible que CSS no sea necesariamente la mejor opción para todas las vías de donación de corazón. Por ejemplo, los corazones obtenidos a través de la vía de donación después de la muerte circulatoria (DCD) se mantienen y se evalúa su viabilidad utilizando la perfusión normotérmica en máquina, mientras que los corazones obtenidos a través de la vía de donación después de la muerte encefálica (DBD) se pueden preservar utilizando CSS o perfusión con máquina hipotérmica. Otro factor determinante importante para la estrategia de preservación utilizada es la cantidad de isquemia caliente (para la DCD) o isquemia fría (para la DBD) a la que se somete el corazón durante la obtención y el transporte del órgano.
Muchos centros utilizan suplementos farmacológicos adicionales de la solución de preservación cardíaca para aumentar la tolerancia isquémica y mejorar la función cardíaca después del trasplante. Los estudios en roedores de nuestro laboratorio demostraron que la suplementación de la cardioplejia con eritropoyetina y trinitrato de glicerilo fue capaz de mejorar significativamente la recuperación funcional cardíaca después de un almacenamiento prolongado en frío del corazón del donante 1,2. Estos estudios luego progresaron a estudios porcinos de preservación del corazón de donantes y proporcionaron la base preclínica que condujo a la incorporación de eritropoyetina y trinitrato de glicerilo en la solución de cardioplejia de corazones obtenidos a través de una vía DCD utilizando perfusión con máquina normotérmica 3,4,5. En la actualidad, la suplementación con eritropoyetina y trinitrato de glicerilo también se utiliza en las unidades de trasplante australianas para las recuperaciones cardíacas clínicas de DBD que incorporan CSS. El objetivo general del protocolo de perfusión de corazón de rata trabajador aislado (IWRH, por sus siglas en inglés) que se describe a continuación es probar las estrategias de preservación del corazón del donante en un entorno de laboratorio y probar su eficacia para preservar la función cardíaca del donante después de la reperfusión. El protocolo de corazón de rata de trabajo aislado descrito se ha utilizado durante más de dos décadas en nuestro laboratorio y ha demostrado ser extremadamente útil en la detección de posibles suplementos y/o estrategias que pueden mejorar la preservación del corazón del donante 2,7,8,9.
Dada la naturaleza sensible de la función basal del corazón, se debe tener cuidado de mantener el equipo de perfusión limpio y con componentes compatibles. Por ejemplo, se debe utilizar el tubo de PVC correcto. Algunos materiales de los tubos, como la silicona, pueden contribuir a reducir el flujo aórtico y la contractilidad, lo que puede deberse a la pérdida de oxígeno a través del tubo. Si bien existen circuitos aislados de perfusión cardíaca de rata disponibles comercialmente…
The authors have nothing to disclose.
Los estudios descritos aquí han sido financiados por subvenciones otorgadas a P.S Macdonald por el Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia, la Fundación de la Clínica St Vincent y la Subvención de Investigador Senior de la Capacidad de Investigación Cardiovascular de NSW Health.
1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box | Bio Strategy Pty Ltd | 0030.125.150 | |
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500 | Sigma-aldrich Pty Ltd | CLS430791-500ea | |
BP Transducer/Cable kit | ADInstruments | MLT1199 | Data Acquisition |
Bridge Amp | ADInstruments | FE221 | Data Acquisition |
Carbogen 555G2 | BOC | BOC002 | |
Checktemp1 thermometer | Hanna Instruments | HI98509 | Rig Construction |
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12 | Thomas Scientific | 2848Y40 | Rig Construction |
Clamp W/Extension Stem Med. | Thomas Scientific | 8847T08 | Rig Construction |
Clamp W/Extension Stem Sm. | Thomas Scientific | 8847T02 | Rig Construction |
Clips, Vessel, 60 g Pressure | Coherent Scientific | 14121 | Surgical Equipment |
Closed Connector | Thomas Scientific | 8847E25 | Rig Construction |
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24 | Specialist Medical Supplies | S195 | Surgical consumables |
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser | Custom Blown Glassware Pty Ltd | N/A | Rig Construction |
Custom Made 750 mL Reservoir | Custom Blown Glassware Pty Ltd | N/A | Rig Construction |
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra | Sigma-aldrich Pty Ltd | G7528-1Kg | To make Krebs Buffer |
Dual Channel Console | ADInstruments | TS402 | Data Acquisition |
Erlenmyer flasks 2 L | |||
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100 | Bio-strategy Pty Ltd | 1822047 | |
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD | Coherent Scientific | 14114 | Surgical Equipment |
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated | Met-App Australia Pty Ltd | 1352 | Rig Construction |
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts) | Thermoline Scientific | TU3 | Rig Construction |
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115 | Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd | 1258693 | Drugs |
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL | Cenvet Australia Pty Ltd | X5010 | Anaesthetic |
Johns Hopkins Bulldog Clamp | Coherent Scientific | CS-WPI-14117 | |
Ketamine 100 mg/50 mL | Provet (NSW) Pty Ltd | KETAI1 | Anaesthetic |
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply | Bio Strategy Pty Ltd | MA048-500g | To make Krebs Buffer |
Male/Female Hinged Adapter | Thomas Scientific | 8847V08 | Rig Construction |
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor | John Morris | 1015164 | Rig Construction |
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved | Coherent Scientific | WPI-501748 | Surgical Equipment |
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight | Coherent Scientific | WPI-501252 | Surgical Equipment |
Mounting Hardware F/2-HEADS SS | John Morris | 1014414 | Mounting screws for pump heads |
Open-sided connector | Thomas Scientific | 8847E05 | Rig Construction |
Paraformadehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Sample processing |
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g | VWR Chemicals | 26764.26 | To make Krebs Buffer |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich Pty Ltd | P5379-500g | To make Krebs Buffer |
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software | ADInstruments | ML826 | Computer Hardware and Software |
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF | ADInstruments | ME4PXN | Rig Construction |
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10 | BSN Medical (Aust) Pty Ltd | 73252-36 | |
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK | Merck Millipore | SX0004701 | Rig Construction |
Silicone O-Ring 5-329 10/PK | Merck Millipore | XX1104707 | Rig Construction |
Single Buret Clamp | Thomas Scientific | 8847T32 | Rig Construction |
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler) | Sigma-aldrich | 59277 | Rig Construction |
Sm. 360 Rotation Connector | Thomas Scientific | 8847E35 | Rig Construction |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Pty Ltd | S6297 – 250g | To make Krebs Buffer |
Swinnex Filter Holder, 47 mm | Merck Millipore | SX0004700 | Rig Construction |
syringes 1 mL box/100 | Becton Dickinson Pty Ltd | 302100 | |
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm | Met-App Australia Pty Ltd | 1356 | Rig Construction |
Tubing Flowmeter Module TS410 | ADInstruments | TS410 | Data Acquisition |
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC | Thermo Fisher | NAL 8701-0600 | Rig Construction |
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC | Thermo Fisher | NAL 8701-0900 | Rig Construction |
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll | Thermo Fisher | NAL 8701-4120 | Rig Construction |
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades | Coherent Scientific | WPI-500-086 | Surgical Equipment |
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray | Thermoline Scientific | TLWB-30 | Rig Construction |