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Biología

Extracción mejorada de ADN de bajo peso molecular de aguas residuales para una evaluación integral de la resistencia a los antimicrobianos

Published: July 19, 2024
doi:
10.3791/66899
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1Ashoka University

Summary

Aquí, presentamos una técnica simple para evaluar la resistencia a los antimicrobianos (RAM) ambiental mediante el aumento de la proporción de ADN extracelular de bajo peso molecular. El tratamiento previo con PEG al 20%-30% y NaCl 1,2 M permite la detección de genes de AMR tanto genómicos como transferidos horizontalmente. El protocolo se presta a un proceso sin kits con optimización adicional.

Abstract

Se reconoce que la vigilancia ambiental es una herramienta importante para evaluar la salud pública en la era posterior a la pandemia. El agua, en particular las aguas residuales, se ha convertido en la fuente de elección para muestrear las cargas de patógenos en el medio ambiente. Las aguas residuales de los desagües abiertos y las plantas de tratamiento de aguas comunitarias son un reservorio de patógenos y genes de resistencia a los antimicrobianos (RAM), y con frecuencia entran en contacto con los seres humanos. Si bien existen muchos métodos para rastrear la resistencia a los antimicrobianos en el agua, aislar ADN de buena calidad a altos rendimientos de muestras heterogéneas sigue siendo un desafío. Para compensar, los volúmenes de muestra a menudo deben ser altos, lo que crea restricciones prácticas. Además, el ADN ambiental se fragmenta con frecuencia, y las fuentes de AMR (plásmidos, fagos, ADN lineal) consisten en ADN de bajo peso molecular. Sin embargo, pocos procesos de extracción se han centrado en métodos para la extracción de alto rendimiento de ADN lineal y de bajo peso molecular. Aquí, se presenta un método simple para la extracción lineal de ADN de alto rendimiento a partir de pequeños volúmenes de aguas residuales utilizando las propiedades de precipitación del polietilenglicol (PEG). Este estudio aboga por el aumento de los rendimientos generales de ADN de las muestras de agua recogidas para los análisis metagenómicos mediante el enriquecimiento de la proporción de ADN lineal. Además, la mejora del ADN de bajo peso molecular supera el problema actual de la falta de muestreo de la resistencia a los antimicrobianos ambientales debido a un enfoque en el ADN intracelular y de alto peso molecular. Se espera que este método sea particularmente útil cuando existe ADN extracelular pero en bajas concentraciones, como en el caso de los efluentes de las plantas de tratamiento. También debería mejorar el muestreo ambiental de fragmentos de genes de resistencia a los antimicrobianos que se propagan a través de la transferencia horizontal de genes.

Introduction

El SARS-CoV-2 y sus secuelas subrayaron la importancia de la vigilancia ambiental en el seguimiento y la predicción de brotes de enfermedades infecciosas 1,2. Si bien las pandemias virales son evidentes, el aumento de la resistencia a los antimicrobianos (RAM) a menudo se describe como una pandemia insidiosa y que constituye un importante problema de salud pública en todo el mundo 3,4. En consecuencia, existe una necesidad urgente de estrategias coordinadas para comprender la evolución y la propagación de la resistencia a los antimicrobianos. Las masas de agua, así como las aguas residuales, pueden servir como reservorios tanto para los patógenos como para la resistencia a los antimicrobianos 5,6,7,8. Las fuentes de agua compartidas son, por lo tanto, una potente fuente de transmisión de enfermedades entre los seres humanos, especialmente en los países de ingresos bajos y medianos (PIMB), donde la falta de higiene y la superpoblación van de la mano 9,10,11. El análisis de las fuentes de agua se ha empleado durante mucho tiempo para evaluar la salud de la comunidad 12,13,14. Recientemente, las aguas residuales de las plantas de tratamiento de aguas residuales urbanas demostraron ser un buen indicador de avance de los casos de COVID en la clínica 1,2,15,16,17,18.

En comparación con el seguimiento de enfermedades específicas, la detección y el seguimiento de la resistencia a los antimicrobianos en el medio ambiente plantean un problema más complejo. El gran número de antibióticos en uso, los diversos genes de resistencia, las diferentes presiones de selección local y la transferencia horizontal de genes entre bacterias dificultan la evaluación de la verdadera carga de RAM y, una vez evaluada, su correlación con las observaciones clínicas 19,20,21,22. Como resultado, mientras que la vigilancia concertada de la RAM clínica está siendo llevada a cabo por varias organizaciones en todo el mundo 3,23,24, la vigilancia ambiental de la RAM aún está en pañales, revisada en 19,25,26.

En los últimos años, se han descrito diferentes métodos para el seguimiento de la RAM ambiental 5,27, revisados en28,29. El punto de partida de la mayoría de ellos es la extracción de ADN de buena calidad a partir de muestras ambientales heterogéneas, lo que en sí mismo es un desafío. Además, el ADN ambiental suele estar fragmentado debido a la exposición a entornos hostiles. El ADN extracelular fragmentado ha sido reconocido durante mucho tiempo como un importante reservorio de genes de AMR (revisado en 30,31,32), con el potencial adicional de entrar y salir de las bacterias a través de la transferencia horizontal de genes. Por lo tanto, es importante que cualquier protocolo que tenga como objetivo medir la carga de RAM en el medio ambiente muestree ADN lineal y de bajo peso molecular lo mejor posible. Sorprendentemente, ha habido poco enfoque en el desarrollo de métodos específicos para la extracción de alto rendimiento de ADN lineal y de bajo peso molecular: este trabajo se centra en abordar la brecha.

Un método común y sencillo para precipitar el ADN es combinar polietilenglicol (PEG) y sales como el cloruro de sodio (NaCl)33. El PEG es un agente de aglomeración macromolecular utilizado para lograr la precipitación específica del tamaño de los fragmentos de ADN34,35. Cuanto menor sea la concentración de PEG, mayor será el peso molecular del ADN que se puede precipitar de manera eficiente. Muchos estudios han utilizado PEG durante la extracción ambiental de ADN y ARN 1,2 (resumidos en la Tabla 1 17,33,36,37,38,39) ya sea en el paso final 33,36,37 o para concentrar grandes muestras de agua para la extracción de partículas virales como con el SARS-CoV-2 15,40. En el trabajo actual, se encuentra que las concentraciones de PEG utilizadas previamente para las extracciones de ADN ambiental (determinadas en gran medida por protocolos de vigilancia viral) no capturan ADN lineal de bajo peso molecular. Por lo tanto, pierden la oportunidad de muestrear fragmentos cortos de ADN y no son adecuados para evaluar con precisión el contenido de RAM. Este estudio ha explotado las propiedades del polietilenglicol y el cloruro de sodio para precipitar eficazmente fragmentos de ADN lineal de bajo peso molecular con un alto rendimiento que puede, en el futuro, conducir a un método de extracción de ADN rentable. Este método se puede utilizar para enriquecer la proporción de ADN fragmentado y de bajo peso molecular de muestras naturales complejas, capturando así una imagen más precisa de la resistencia a los antimicrobianos ambientales. Con un poco más de refinamiento, la técnica se presta a una aplicación fácil y de bajo costo por parte de las corporaciones municipales locales y otros organismos gubernamentales para su uso como herramienta de vigilancia con una capacitación técnica mínima.

Protocol

1. Toma de muestras de aguas residuales Sumerja un vaso de polipropileno de 500 mL en el desagüe abierto o en el depósito de la planta de tratamiento de aguas residuales (STP) y recoja ~ 300 mL de muestra de aguas residuales. Transfiera ~ 250 mL de la muestra a una botella de polipropileno esterilizada en autoclave de 250 mL. Enrosca la tapa de la botella y séllala con una película de plástico. Mantenga el frasco en posición vertical dentro de una bolsa cerrada. Transporte la muestra en posición vertical en un recipiente cerrado a temperatura ambiente. Inactivar con calor la muestra a 70 °C en un horno de aire caliente durante 4 h antes de procesarla para la extracción de ADN. 2. Extracción de ADN de muestras de aguas residuales Una vez que la muestra de aguas residuales se enfríe, agite las muestras a máxima velocidad y deje que los desechos/lodos se asienten. Decantar 27,5 mL de las aguas residuales en tubos de centrífuga de 50 mL y añadir 13,5 g de PEG-8000 (concentración final 30%) y 3 g de NaCl (concentración final 1,2 M) y mezclar bien hasta que se disuelva por completo. Incubar la muestra durante la noche (~16-18 h) a 4 °C. Centrifugar la muestra a 15.500 x g a 4 °C durante 30 min. Deseche el sobrenadante.NOTA: PEG-8000 al 30% es altamente viscoso y el pellet puede desprenderse mientras se desecha el sobrenadante. El sobrenadante debe decantarse lenta y cuidadosamente para asegurarse de que el pellet no se pierda. Los pasos 2.6 a 2.23 se realizan utilizando el kit de extracción de ADN del suelo de acuerdo con las instrucciones del kit con algunas modificaciones. Disuelva el pellet en 800 μL de la solución de lisis del kit y agregue la solución al tubo de perlas de circonio mezclado.NOTA: Si procesa volúmenes más grandes, agrupe los gránulos del número deseado de tubos. Por ejemplo, si se procesan 160 mL de muestra; habrá cuatro tubos de 50 mL que contendrán aguas residuales con PEG y NaCl. Después de centrifugar los cuatro tubos a 15.500 x g a 4 °C durante 30 min, deseche el sobrenadante de los cuatro tubos. Agregue 200 μL de solución CD1 a cada uno, vuelva a suspender los gránulos y acompáñelos en un tubo de perlas. Asegure el tubo de cuentas horizontalmente en un vórtice. Agite el tubo a máxima velocidad durante 20-30 min.NOTA: El vórtice prolongado garantiza la lisis y homogeneización completas de las muestras, lo que mejora el rendimiento del ADN. Gire los tubos a 8.000 x g durante 15 s para asentar las perlas en la parte inferior, eliminar la espuma y transferir el sobrenadante completamente del tubo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Algunas cuentas también pueden transferirse durante este paso. Centrifugar el sobrenadante a 15.000 x g durante 1 min. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio de 2 mL. El sobrenadante puede contener todavía algunas partículas en suspensión. Añadir 200 μL de solución precipitante y vórtice a velocidad máxima durante 5 s. Incubar a 4 °C durante 5 min.NOTA: La incubación a 4 °C aumenta la eficiencia de la precipitación de proteínas y desechos celulares mientras el ADN permanece en solución. Es posible pausar el protocolo en este paso hasta 2 h sin una disminución significativa en el rendimiento y la calidad del ADN extraído. Centrifugar a 15.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente (RT). Evite el gránulo y transfiera el sobrenadante transparente a un tubo de microcentrífuga limpio de 2 mL. Añadir 600 μL de tampón de unión por cada 700 μL de sobrenadante y vórtice a velocidad máxima durante 5 s. Cargue 700 μL del lisado en una columna de centrifugación de sílice, incube durante 2 minutos y centrifugue a 15.000 x g durante 1 minuto.NOTA: La incubación de lisado en la columna de sílice mejora la unión del ADN a la columna, lo que resulta en un mejor rendimiento de ADN. Deseche el flujo y repita el paso 2.14 hasta que todo el lisado haya pasado a través de la columna de centrifugado. Coloque con cuidado la columna de centrifugado en un tubo de recolección limpio de 2 ml. Asegúrese de que no se salpique ningún flujo sobre la columna de centrifugado. Añada 500 μL de tampón de lavado a la columna de centrifugado y centrifuga la columna de centrifugado a 15.000 x g durante 1 min. Deseche el flujo y devuelva la columna de centrifugado al mismo tubo de recolección de 2 mL. Añada 500 μL de tampón de lavado de etanol a la columna de centrifugado. Centrifugar a 15.000 x g durante 1 min. Deseche el flujo y coloque la columna de centrifugado en un nuevo tubo de recolección de 2 ml. Centrifugar a 16.000 x g durante 2 min para eliminar el etanol residual. Coloque la columna de centrifugado en un nuevo tubo de 1,5 ml. Añadir 100 μL de tampón de elución (precalentado a 55 °C) en el centro de la membrana del filtro blanco e incubar durante 5 min.NOTA: El tampón de elución calentado, junto con la incubación en la membrana, aumenta la eficiencia de la elución del ADN, especialmente el ADN de alto peso molecular. Centrifugar a 15.000 x g durante 1 min. Deseche la columna de giro. Al ADN eluido, añadir 10 μL de NaCl 3 M (1/10 de volumen de ADN eluido) y 250 μL de etanol absoluto refrigerado (2,5 volumen de ADN eluido). Invertir para mezclar bien y girar el contenido a 8.000 x g durante 15 s. Incubar la mezcla de ADN y etanol a -20 °C durante al menos 1 h.NOTA: La incubación de la mezcla de ADN-etanol puede aumentarse a 16 h sin que disminuya significativamente el rendimiento o la calidad del ADN extraído. Centrifugar a 19.000 x g a 4 °C durante 30 min. Desechar el sobrenadante por decantación. Agregue 500 μL de etanol refrigerado al 70% al pellet. Centrifugar a 19.000 x g a 4 °C durante 15 min. Desechar el sobrenadante por decantación. Invierta y golpee suavemente el tubo sobre papel de seda para eliminar el etanol residual por capilaridad. Seque completamente el pellet de ADN manteniendo los tubos abiertos en un bloque calefactor durante 5-10 minutos a 37 °C hasta que todo el etanol se haya evaporado. Vuelva a suspender el pellet de ADN en 30-50 μL de agua bidestilada esterilizada en autoclave (ddH2O). Incubar a 37 °C durante 5-10 min. Centrifugar el ADN a 8.000 x g durante 15 s. Seleccione la aplicación dsDNA en la configuración de ácidos nucleicos en un espectrofotómetro Nanodrop.Limpie el pedestal con papel de seda sin pelusa y agua. Utilice ddH2O para blanquear el instrumento y, a continuación, cargue 2 μL de la muestra de ADN en el pedestal. Mida las relaciones de concentración y absorbancia (A260/280 y A260/230) para determinar la pureza. Almacene la muestra de ADN a -20 °C. 3. Precipitación de ADN lineal amplificado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para comprobar la recuperación de ADN en un rango de pesos moleculares Utilizando ADN genómico de E. coli MG155, amplifique fragmentos de genes mediante PCR para generar un conjunto de fragmentos lineales a partir de los siguientes genes: fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S rRNA, marR (consulte la Tabla 2 para conocer las secuencias de cebadores y las condiciones de PCR). Purifique los productos de PCR utilizando el kit de purificación de PCR y agrupe los productos de PCR juntos. Divida los amplicones agrupados en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con volúmenes iguales: etiquete un tubo como ‘ADN de entrada’. Añadir PEG y NaCl según las condiciones deseadas (9%, 20%, 30% PEG-8000; 0,3 M, 1,2 M de NaCl) a cada uno de los tubos, excepto el etiquetado como “ADN de entrada”, y completar el volumen final a 1 mL. Incubar los tubos durante la noche (~16-18 h) a 4 °C.NOTA: Para el resto de los pasos hasta la versión 3.16, el ‘ADN de entrada’ se mantiene sin cambios en la nevera. Centrifugar los tubos en una microcentrífuga de sobremesa según la velocidad deseada (15.000 x g o 20.000 x g) durante 1 h a 4 °C. Retire con cuidado 900 μL del sobrenadante del lado opuesto al pellet con una micropipeta. Primer lavado con etanol: Agregue 900 μL de etanol frío al 70% al pellet y mezcle invirtiendo suavemente los tubos. Girar los tubos a la misma velocidad que se utilizó en el paso 3.6 (15.000 x g o 20.000 x g) durante 30 min a 4 °C. Retirar el sobrenadante por decantación. Segundo lavado con etanol: Agregue 500 μL de etanol refrigerado al 70% al pellet. Haga girar los tubos a la misma velocidad que se utilizó en el paso 3.6 (15.000 x g o 20.000 x g) durante 30 minutos a 4 °C. Desechar el sobrenadante por decantación. Invierta y golpee suavemente el tubo sobre papel de seda para eliminar el etanol residual por capilaridad. Seque completamente el gránulo de ADN manteniendo los tubos abiertos en un bloque calefactor durante 5-10 minutos a 37 °C hasta que se evapore todo el etanol. Vuelva a suspender el pellet en 20 μL de agua bidestilada esterilizada en autoclave. Mida la concentración de ADN precipitado por las diferentes condiciones y el ‘ADN de entrada’ utilizando un espectrofotómetro o fluorómetro Nanodrop. Cargue el ADN precipitado en un gel de agarosa al 1% para la visualización del ADN.   

Representative Results

Establecimiento de un protocolo para la extracción de ADN de alto rendimiento a partir de muestras de aguas residualesSe utilizó una versión modificada de los protocolos previamente establecidos para la extracción de ADN y ARN de alta calidad a partir de muestras de agua17. Las muestras se obtuvieron de desagües abiertos, así como de plantas de tratamiento de aguas residuales en la región de Delhi-NCR, en el norte de la India. Después d…

Discussion

La resistencia a los antimicrobianos es una de las 10 principales amenazas para la salud en la actualidad, según la lista de la OMS, y la vigilancia ambiental de la resistencia a los antimicrobianos es reconocida como una herramienta importante en todo el mundo. Como se mencionó en la introducción, un registro completo de la resistencia a los antimicrobianos ambientales incluye ADN de bajo peso molecular, fragmentado y extracelular. El protocolo de preprocesamiento descrito aquí, que utiliza una alta concentración d…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos el apoyo financiero de la Fundación Rockefeller (Subvención de la Fundación Rockefeller Número 2021 HTH 018) como parte del equipo de APSI India (Alianza para las Innovaciones en Vigilancia de Patógenos https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). También agradecemos la ayuda financiera proporcionada por Axis Bank para apoyar esta investigación y la Escuela de Biociencias Trivedi de la Universidad de Ashoka para equipos y otro tipo de apoyo.

Materials

24-seat microcentrifuge Eppendorf Centrifuge 5425 R EP5406000046
Absolute Ethanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Ethanol absolute for analysis) Supelco 100983-0511
Agarose Invitrogen 16500500
Bench top refrigerated centrifuge Eppendorf Centrifuge 5920 R EP5948000131
ChemiDoc Imaging System BioRad 12003153
DNeasy PowerSoil Pro Kit Qiagen 47014
DNeasy PowerWater Pro Kit Qiagen 14900-100-NF
dNTPs (dNTP Mix 10mM Each,0.2 mL, R0191) Thermo Fisher R0191
DreamTaq DNA Polymerase, 5 U/µL + 10x DreamTaq Buffer* Thermofscientific EP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder Invitrogen 10488091
Maxiamp PCR tubes 0.2 mL Tarsons 510051
Molecular Biology Grade Water for PCR HiMedia ML065-1.5ML
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific 13400519
Parafilm Bemis S37440
PEG-8000 SRL 54866
QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit Qiagen 28506
Qubit 4 Fluorometer (with WiFi) Thermofisher Q33238
Qubit Assay Tubes Thermofisher Q32856
Qubitt reagent kit for ds DNA, broad range Thermo Scientific Q32853 (500 assays)
Sodium Chloride HiMedia TC046M-500G
SYBR Safe DNA Gel Stain Invitrogen S33102
T100 Thermal Cycler BioRad 1861096
Thermo Cycler (ProFlex 3 x 32-well PCR System) Applied Biosystems 4484073
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1125
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Citar este artículo
Karan, J., Mandal, S., Khan, G., Arya, H., Samhita, L. Enhanced Extraction of Low-Molecular Weight DNA from Wastewater for Comprehensive Assessment of Antimicrobial Resistance . J. Vis. Exp. (209), e66899, doi:10.3791/66899 (2024).
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