Histoflow Cytometry를 이용한 High-parameter Histology 이미지 생성 및 분석

면역 체계와 신경교세포의 세포에 의해 유발되는 염증은 각 집단이 다른 ^1,2,3의 활동을 촉진할 수 있는 CNS의 만성 장애에 기여할 수 있습니다. 면역 체계가 중추신경계의 이러한 요소와 상호 작용하여 중추신경계 염증을 촉진하는 방법을 이해하는 것은 현재 주요 관심 주제이며 단세포 RNA 염기서열 분석과 같은 고분자 기술에 의해 크게 촉진되었습니다. 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 통해 우리는 여러 CNS 질환에서 신경교세포와 면역 체계 사이에 광범위한 통신이 발생한다는 것을 발견했습니다 ^4,5,6. 이러한 상호 작용이 이러한 장애에 어떻게 영향을 미치는지 이해하는 것은 이러한 질병의 생물학을 설명하는 데 중요합니다.

단일 세포 염기서열 분석 분석의 한 가지 문제는 이러한 기술을 사용하여 단일 세포 또는 핵을 얻기 위해 조직을 파괴해야 하므로 공간 정보가 완전히 손실된다는 것입니다. 조직에서 세포가 어디에 존재하는지 아는 것은 염증을 유발하는 세포의 역할을 이해하는 데 중요합니다. 예를 들어, B 세포와 같은 면역 세포는 신경 염증 중에 CNS에 농축 될 수 있습니다. 그러나 그들은 CNS 실질에 거의 들어가지 않고 대신 CNS 장벽⁷에 집중합니다. 그들의 국소화를 감안할 때, 이러한 세포가 CNS 실질의 신경교세포와 물리적으로 상호 작용하여 CNS 염증에 기여할 가능성은 낮으며, 이는 신경교세포와 가질 수 있는 모든 상호 작용이 분비된 인자를 통해 발생할 것임을 시사합니다. 또한, 중추신경계 장애에서 발생하는 병리학은 종종 구조 ^8,9를 가지고 있어 조직 내 세포의 국소화가 세포가 장애에 적극적으로 기여하고 있는지 아니면 방관자인지를 비판적으로 결정할 수 있습니다. 따라서 병리학에서 세포의 역할을 평가하기 위해 공간 방향을 사용하는 것이 필수적입니다.

조직 내 세포 연구는 일반적으로 면역조직화학(immunohistochemistry) 또는 면역 형광 현미경(immune fluorescence microscopy)을 사용하여 수행되어 왔습니다. 이러한 기술의 문제점은 일반적으로 최대 4개의 매개변수만 동시에 이미지화할 수 있다는 것입니다. 이는 유세포 분석 및 단일 세포 RNA 염기서열 분석 분석을 통해 많은 세포 집단이 식별을 위해 두 개 이상의 매개변수를 필요로 한다는 것을 알고 있기 때문에 이러한 기술의 주요 제한 사항입니다. 또한, 필요한 파라미터의 수는 세포 유형⁽¹⁰)의 특정 서브셋을 찾을 때 전형적으로 증가한다. 따라서 세포의 부분 집합이 조직 내에서 어떻게 상호 작용할 수 있는지 연구하기 위해 표준 이미징 기술을 사용하는 것은 비실용적입니다.

이 문제는 공간 RNA 염기서열분석(spatial RNA sequencing⁾¹¹ 및 이미징 질량 세포분석(imaging mass cytometry⁾¹²과 같은 공간 정보를 유지할 수 있는 새로운 고-파라미터 방법을 통해 부분적으로 극복되었다. 이러한 기술은 유용하지만 널리 사용할 수 없고, 3차원 데이터를 2차원으로 줄이고, 실행하는 데 상당한 전문 지식이 필요한 등 몇 가지 문제가 있습니다. 순차적 염색(sequential staining)으로 알려진 또 다른 기법은 조직을 한 세트의 항체로 염색한 후 다른 항체 세트로 염색하기 전에 이전 항체 세트를 비활성화하는 것으로, 특수 장비나 전문 지식 없이도 고-파라미터 조직학을 달성할 수 있다 13,14,15. 그러나 순차적 염색은 매우 노동 집약적일 수 있으며 많은 현미경 검사 시간이 필요하므로 개인용 현미경이 없는 실험실에는 실용적이지 않을 수 있습니다. 따라서 널리 사용 가능하고 적시에 현미경에서 한 번에 이미지화할 수 있는 형광 파라미터의 수를 확장할 수 있는 기술이 필요합니다.

일단 높은 파라미터 데이터가 수집되면, 또 다른 문제가 발생한다: 기존의 이미지 분석 방법으로는 데이터를 성공적으로 분석할 수 없을 것이다. 수동 카운팅 또는 임계값과 같은 기법은 분석이 단일 파라미터로 구성되거나 여러 마커가 중첩 신호만 카운팅되는 동일한 국소화를 갖는 경우에만 실행 가능합니다. 이러한 제한으로 인해 기존 분석은 매개 변수가 높은 데이터 세트로 작업하기에 적합하지 않습니다. 이러한 데이터 세트의 성공적인 분석은 조직학 이미지에서 단일 세포를 분할한 다음 세포 유형을 식별하기 위해 유세포 분석과 같은 게이팅 전략을 수행함으로써 달성되었습니다^16,17. 그러나 이러한 분석에 영향을 미치는 또 다른 문제는 이러한 기술이 물리적으로 접촉하는 세포를 정확하게 분리할 수 있는 방법을 사용하지 않기 때문에 관심 있는 모든 셀이 물리적으로 서로 분리되어 있는 데이터 세트에서만 작동한다는 것입니다. 따라서, 세포가 물리적으로 접촉되어 있더라도 조직학 단면에 대한 단일 세포 분석을 수행할 수 있는 새로운 방법이 필요합니다.

이 기사에서는 이전에 소개된 histoflow cytometry라는 간단한 프로토콜에 대해 설명합니다.¹⁸ 이 프로토콜은 널리 사용 가능한 현미경을 사용하여 동시에 이미징할 수 있는 형광 파라미터의 수를 확장합니다. 이 프로토콜은 스펙트럼적으로 겹치는 염료로 조직을 염색한 다음 스펙트럼 보정을 사용하여 겹치는 채널에서 블리드스루를 제거하여 선명한 단일 염색을 얻는 방식으로 작동합니다. 고파라미터 조직학 이미지의 분석을 용이하게 하기 위해, 유세포분석과 같은 게이팅 전략을 사용하여 세포를 별개의 집단으로 분류하기 위해 조직 절편에서 단일 세포를 추출하는 상세한 분석 파이프라인이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 세포가 확산되어 존재하는 조직과 세포가 밀접하게 압축된 조직에서 작동하므로 이 기술은 항상성 및 신경염증 모두에서 CNS와 같은 조직의 연구에 다재다능합니다. 따라서 Histoflow 유세포분석은 공간 정보를 유지하면서 세포를 정의하기 위해 여러 세포 마커가 필요한 복잡한 세포 유형 간의 상호 작용을 연구하는 데 유용한 기술입니다.