Este protocolo describe metodologías para establecer un modelo de implantación embrionaria in vitro simple y eficiente para evaluar las moléculas relevantes que afectan el proceso de implantación embrionaria.
La implantación embrionaria es el primer paso para el establecimiento de un embarazo exitoso. Un modelo in vitro para la implantación de embriones es fundamental para la investigación biológica básica, el desarrollo de fármacos y el cribado. En este trabajo se presenta un modelo in vitro sencillo, rápido y altamente eficiente para la implantación de embriones. En este protocolo, primero introducimos la adquisición de blastocisto de ratón y la preparación de células de adenocarcinoma de endometrio humano (Ishikawa) para la implantación, seguido del método de cocultivo para embriones de ratón y células de Ishikawa. Por último, realizamos un estudio para evaluar el impacto de concentraciones variables de 17-β-estradiol (E2) y progesterona (P4) en las tasas de adhesión embrionaria basadas en este modelo. Nuestros hallazgos revelaron que las altas concentraciones deE2 redujeron significativamente la adhesión embrionaria, mientras que la adición de progesterona podría restaurar la tasa de adhesión. Este modelo ofrece una plataforma sencilla y rápida para evaluar y cribar las moléculas implicadas en el proceso de adhesión, como las citocinas, los fármacos y los factores de transcripción que controlan la implantación y la receptividad endometrial.
La implantación del embrión, el paso inicial de un embarazo exitoso, es crucial para comprender su base biológica y abordar los desafíos de la infertilidad. Sin embargo, las restricciones éticas plantean limitaciones significativas en la recolección de muestras clínicas de embriones humanos, lo que dificulta la investigación sobre las intrincadas interacciones entre los embriones humanos y el endometrio durante el embarazo temprano1. Una comprensión profunda de estos complejos mecanismos es vital para avanzar en la investigación biológica fundamental, el descubrimiento de fármacos y la salud reproductiva.
Los modelos in vitro anteriores empleaban modelos de adhesión en los que las células epiteliales endometriales humanas monocapa (RL95-2)2 se cocultivaban con sustitutos embrionarios, como las células de coriocarcinoma BeWo, JAr o Jeg-33 . Sin embargo, la selección del tamaño de los esferoides, que oscilaba entre 70 y 100 μm, fue crucial, ya que los agregados de células más grandes o más pequeños podrían comprometer la precisión del experimento. En particular, solo el 25% de los esferoides en cada preparación cumplieron con el estándar para el tamaño4 adecuado, y hubo diferencias significativas en comparación con las condiciones fisiológicas de los blastocistos.
Además, los sistemas de cultivo tridimensional (3D) para el endometrio y el blastocisto ofrecen un entorno fisiológicamente más relevante5, pero requieren una gran experiencia técnica, un crecimiento celular lento, altos costos de recursos y mantenimiento, dificultad en la estandarización y baja reproducibilidad6.
En este protocolo, presentamos un modelo in vitro rentable y rápido de implantación de embriones que puede desarrollarse y utilizarse en la mayoría de los laboratorios. El objetivo general de este método es proporcionar una plataforma fiable y reproducible para estudiar las interacciones entre los embriones y el endometrio en un entorno controlado. Al simular eventos clave de la implantación de embriones in vitro, este modelo tiene como objetivo cerrar la brecha entre los modelos animales y los entornos clínicos, lo que permite una investigación más precisa y específica.
En comparación con los sustitutos embrionarios, el uso de blastocistos de ratón ofrece una representación fisiológicamente más relevante del proceso de implantación embrionaria in vivo7. Además, la línea celular de Ishikawa, derivada del adenocarcinoma de endometrio humano, posee características mixtas de epitelio glandular y epitelio lumínicouterino 1, lo que le permite expresar enzimas, proteínas estructurales y receptores de esteroides funcionales similares a los que se encuentran en el endometrio normal, proporcionando así un sustrato fisiológicamente relevante para la implantación del embrión. La simplicidad y rapidez del sistema de cocultivo permite el cribado y la realización de pruebas de drogas de alto rendimiento 8,9,10. Al proporcionar una plataforma robusta y reproducible, este método ofrece una oportunidad para avanzar en nuestra comprensión de la implantación de embriones y su impacto en la salud humana.
La simplicidad y rapidez del modelo in vitro propuesto para la implantación embrionaria ofrece ventajas notables para el cribado de fármacos en fase temprana y otras aplicaciones de investigación. El protocolo sencillo, junto con la naturaleza de alto rendimiento de las líneas celulares de Ishikawa, lo convierte en un candidato ideal para pantallas a gran escala, particularmente en las primeras etapas del descubrimiento de fármacos. Liang13 encontró que la eliminación de TAGLN2 dis…
The authors have nothing to disclose.
Nuestros estudios fueron apoyados por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82171603), la Fundación de la Comisión Municipal de Salud de Shanghái (202140341), la Comisión de Ciencia y Tecnología de la Municipalidad de Shanghái (23JC1403803) y el Programa de Promoción de la Innovación del NHC y Shanghai Key Labs, SIBPT (RC2023-02).
17-β-estradiol | SIGMA | 3301 | Most potent mammalian estrogenic hormone |
BD Falcon | BD | 353001 | Bacteriological Petri Dishes 35 x 10 mm style w/tight lid, crystal-grade virgin polystyrene, sterile |
Biosafety Cabinet | ESCO | class ![]() |
Aseptic operations, making culture dishes, aliquoting reagents, etc |
CO2 Incubator | Thermo | 8000DH | Embryo culture |
Culture plate | Corning | 3506 | Cell culture |
DMEM/F12 | Gibco | 1133032 | DMEM/F12 (1x), liquid 1:1,Contains L-glutamine and 15 mM HEPES buffer |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099141 | Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin |
Gelatin | SIGMA | G9391 | Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture |
HCG | Nanjing Aibei | M2520 | Sterilization reagent, intraperitoneal injection, 50 IU/mL |
Hyaluronidase | SIGMA | V900833 | Reagent grade, powder |
KSOM | Merck | MR-020P-D | (1x), Powder, w/o Phenol Red, 5 x 10 mL |
L-glutamine | Gibco | 25030081 | L-glutamine-200 mM (100x), liquid |
M2 | Merck | MR-015-D | EmbryoMax M2 Medium (1x), Liquid, with Phenol Red |
Mineral oil | SIGMA | M8410 | Mineral oil is suitable for use as a cover layer to control evaporation and cross-contamination in various molecular biology applications |
Penicillin-Streptomycin, liquid | Gibco | 15140122 | 10,000 Units penicillin (base) and 10,000 units streptomycin (base), utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline |
PMSG | Nanjing Aibei | M2620 | Sterilization reagent ,intraperitoneal injection, 50 IU/mL |
Progesterone | SIGMA | 5341 | Steroid hormone secreted by the corpus luteum during the latter half of the menstrual cycle |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Sodium pyruvate is commonly added to cell culture media as a carbon source in addition to glucose |
Stereomicroscope | Olympus | SZX7 | Embryo retrieval and observation of embryo development |