Trasformazione mitocondriale in Baker

Il lievito Saccharomyces cerevisiae è un modello ampiamente riconosciuto utilizzato per studiare la biogenesi mitocondriale. Poiché il lievito è un organismo anaerobio e facoltativo, è possibile studiare ampiamente le cause e le conseguenze dell’introduzione di mutazioni che compromettono la respirazione. Inoltre, questo organismo possiede strumenti genetici e biochimici amichevoli per studiare le vie mitocondriali. Tuttavia, una delle risorse più potenti per esplorare i meccanismi dell’assemblaggio dei complessi respiratori e della sintesi proteica mitocondriale è la capacità di trasformare i mitocondri e modificare il genoma dell’organello. In precedenza, è stato utile introdurre nel DNA mitocondriale (mtDNA) mutazioni puntiformi o piccole delezioni/inserzioni ^1,2,3,4,5, eliminare i geni ^6,7, effettuare riarrangiamenti genici ^7,8, aggiungere epitopi alle proteine mitocondriali ^9,10, trasferire geni dal nucleo ai mitocondri^11,12, e introducono geni reporter come BarStar¹³, GFP^14,15, luciferasi¹⁶ e il più utilizzato ARG8^m17,18. Le modificazioni del genoma mitocondriale ci hanno permesso di sezionare e identificare meccanismi che altrimenti sarebbero stati difficili da comprendere. Ad esempio, il gene reporter ARG8^m inserito nel locus COX1 nel DNA mitocondriale è stato fondamentale per capire che Mss51 ha un duplice ruolo nella biogenesi di Cox1. In primo luogo, è un attivatore traduzionale dell’mRNA COX1 e, in secondo luogo, è un chaperone di assemblaggio per la proteina^{Cox1 7,19} di nuova produzione. Questo lavoro presenta un metodo dettagliato per trasformare i mitocondri di S. cerevisiae. Sebbene il protocollo di trasformazione mitocondriale sia stato pubblicato in precedenza il 16,20,21,22,23, un approccio visivo attraverso un video è essenziale per comprendere a fondo le diverse fasi e i dettagli del metodo. Il metodo si compone di varie fasi e si articola in quattro fasi generali:

Figura 1: Panoramica della procedura di trasformazione mitocondriale mediante bombardamento di microproiettili ad alta velocità: 1) Le particelle di tungsteno vengono sterilizzate e preparate prima del rivestimento del DNA. 2) Due diversi plasmidi vengono precipitati sulla superficie dei WP. Uno è un plasmide batterico contenente il costrutto che sarà diretto alla matrice mitocondriale. L’altro è un vettore di espressione del lievito nucleare che trasporta un marcatore di auxotrofia. 3) Un ceppo di lievito recettore privo di DNA mitocondriale (rho⁰) viene coltivato su una fonte di carbonio fermentativa come il galattosio o il raffinosio, che non esercita alcuna repressione del glucosio dell’espressione genica mitocondriale^34,35. La coltura è diffusa su piastre di Petri contenenti il mezzo di bombardamento. 4) I WP rivestiti con plasmidi vengono sparati al ceppo del recettore mediante bombardamento di microproiettili ad alta velocità. 5) Le colonie di Rho^– sintetiche positive contenenti il plasmide mitocondriale vengono selezionate mediante accoppiamento con un ceppo tester. 6) Il costrutto mitocondriale è integrato nel genoma mitocondriale nel locus desiderato accoppiando il ceppo sintetico di Rho^– (donatore) con il ceppo accettore mediante un processo noto come citoduzione. 7) Il recettore positivo, il ceppo aploide che trasporta il costrutto mitocondriale, viene selezionato e purificato in diversi mezzi. Abbreviazioni: WPs = particelle di tungsteno; mtDNA = DNA mitocondriale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Trasformazione di cellule con il costrutto di DNA destinato ad integrarsi nel genoma mitocondriale (Figura 1, passaggi 1-4)
Sebbene sia possibile trasformare direttamente un lievito contenente un genoma mitocondriale completo (rho⁺), la trasformazione è 10-20 volte più efficiente se le cellule mancano di DNA mitocondriale (rho⁰)²⁴. Le particelle di tungsteno (WP) sono rivestite con due diversi plasmidi che saranno co-trasformati. Il primo è un vettore di espressione di lievito 2 μ che trasporta un marcatore di auxotrofia, come LEU2 o URA3 (ad esempio, YEp351 o YEp352, rispettivamente). Se l’introduzione biolistica del DNA nelle cellule di lievito ha successo, i trasformanti cresceranno sul mezzo di auxotrofia (cioè un mezzo privo di leucina o uracile). Questo plasmide è utile per effettuare la prima selezione delle cellule che hanno acquisito il plasmide nucleare; in caso contrario, il numero di colonie risultanti saturerebbe la piastra. Il secondo plasmide è un plasmide batterico (come pBluescript o simili) contenente la costruzione mitocondriale destinata ad essere integrata nel genoma mitocondriale. Il costrutto deve contenere almeno 100 nt di sequenze mitocondriali fiancheggianti 5′ e 3′ per la ricombinazione con la regione mitocondriale di interesse. Nella nostra esperienza, è più probabile che sequenze fiancheggianti più grandi si ricombinino con successo con il locus bersaglio nel genoma mitocondriale.

Un esempio specifico è mostrato nella Figura 2²⁵. In questo esempio, l’obiettivo era quello di eliminare la regione del gene COX1 mitocondriale che codifica per gli ultimi 15 amminoacidi della proteina corrispondente (Cox1ΔC15) (Figura 2A). Il plasmide batterico portatore della mutazione COX1ΔC15 conteneva rispettivamente 395 nt e 990 nt delle regioni 5′ e 3′ non tradotte del gene. Il plasmide è stato derivato da pBluescript (pXPM61) e, insieme al plasmide YEp352 a 2 μ, sono stati coprecipitati sulla superficie dei WP (Figura 2B). I WP sono stati quindi introdotti mediante bombardamento di microproiettili nel ceppo ricevente selezionato (Figura 2C). Questo ceppo, chiamato NAB69²⁶, è un ceppo MATa, rho⁰ che porta gli alleli kar1-1 e ade2 (l’importanza di queste caratteristiche è discussa di seguito). Le cellule sono state piastrate su un terreno di bombardamento privo di uracile per selezionare quelle che hanno acquisito il plasmide a 2 μ (Figura 2C). Le cellule sono state coltivate per 5-7 notti a 30 °C.

Selezione delle cellule che hanno acquisito il plasmide batterico contenente il costrutto mitocondriale e il plasmide nucleare 2 μ che trasporta il marcatore di auxotrofia (Figura 1, fase 5)
Le colonie positive manterranno molte copie del plasmide batterico nei loro mitocondri²². Poiché le cellule trasformate sono originariamente rho⁰, nessuna sequenza mitocondriale supporta la traduzione del costrutto mitocondriale presente nel plasmide; quindi, il gene mitocondriale trasformato non sarà espresso. È necessario accoppiare i trasformanti con un ceppo tester per rilevare le colonie di lievito che hanno acquisito il plasmide mitocondriale. Il genoma mitocondriale del ceppo tester contiene una versione mutata non funzionale del gene di interesse. Dopo l’accoppiamento, i mitocondri si fonderanno e la sequenza mitocondriale inclusa nel plasmide trasformato si ricombinerà con il gene mitocondriale mutato del ceppo tester; di conseguenza, il recupero del gene WT ricostituirà la funzione. Il diploide risultante avrà un fenotipo positivo rilevabile (di solito la capacità di crescere in un mezzo respiratorio o un terreno privo di arginina). Le cellule positive che trasportano il plasmide batterico nei mitocondri sono chiamate “^rho-cells sintetiche”. Nell’esempio specifico della Figura 2D, le rho^– cell sintetiche che trasportano il costrutto COX1ΔC15 (chiamato XPM199) sono state replicate su un terreno privo di uracile (questa è la piastra master da cui sono state purificate le colonie positive). Sono stati anche replicati su un prato del ceppo tester L45²⁷ , che contiene la mutazione non funzionale cox1D369N. Dopo l’accoppiamento per due notti, il genoma mitocondriale di L45 e XPM199 si è ricombinato, dando luogo a un gene COX1 funzionale; Pertanto, i diploidi hanno recuperato la capacità di crescere sui mezzi respiratori. Dalla piastra principale, abbiamo raccolto le colonie positive. Sono stati striati su piastre prive di uracile e i test selettivi sono stati ripetuti per ottenere cellule Rho^– sintetiche pure (Figura 2E). È importante notare che la piastra di prova serve solo per l’identificazione di colonie di ^rho-colonie sintetiche e i mutanti non possono essere recuperati da queste piastre.

Integrazione del costrutto nel genoma mitocondriale del ceppo previsto
Questo passaggio si ottiene mediante un processo chiamato citoduzione^28,29 (Figura 1, passaggio 6). In questo approccio, il ceppo sintetico rho^– (ceppo donatore) viene accoppiato con il ceppo accettore previsto del tipo di accoppiamento opposto. Un requisito essenziale è che almeno uno dei due ceppi di accoppiamento sia portatore della mutazione kar1-1 per impedire la fusione nucleare³⁰. Quindi, l’accoppiamento delle due cellule produce uno zigote binucleato (Figura 3). La rete mitocondriale delle cellule parentali (donatore e accettore) si fonde e le molecole di DNA mitocondriale si ricombinano. Gli zigoti binucleati vengono incubati/recuperati per consentire la gemmazione, che produrrà cellule aploidi. Questi aploidi portano il background nucleare di una delle cellule parentali. Allo stesso modo, gli aploidi possono trasportare il DNA mitocondriale dalla cellula parentale o dal DNA mitocondriale ricombinato di interesse. Tuttavia, la mutazione kar1-1 non è efficace al 100% e alcuni veri diploidi si formeranno durante l’accoppiamento^28,29. Il ceppo sintetico rho^– (donatore, XPM199) portava l’allele kar1-1 nell’esempio. Come marcatore selettivo, aveva l’allele ade2, che lo rendeva un auxotropo per l’adenina (Figura 4). Il ceppo accettore era XPM10, un ceppo rho⁺ che portava il costrutto cox1Δ::ARG8^m, dove il reporter ARG8^m ha sostituito i codoni COX1 nel genoma mitocondriale⁷. La miscela di entrambe le colture cellulari è stata aggiunta a una piastra YPD come goccia per consentire l’accoppiamento. Dopo 3-5 ore, le cellule sono state osservate al microscopio ottico per rilevare la formazione di shmoos (Figura 3B), una forma cellulare associata all’accoppiamento. Dopo il tempo di incubazione/recupero, gli zigoti binucleati sono stati piastrati su un terreno privo di adenina per prevenire la crescita delle cellule del donatore.

Selezione del ceppo aploide che trasporta il genoma mitocondriale di interesse (Figura 1, fase 7)
Dopo la citoduzione è presente una miscela di cellule donatrici, accettori e diploidi. Pertanto, dopo l’incubazione/recupero degli zigoti binucleati, le cellule devono essere coltivate in diversi terreni selettivi per identificare e purificare gli aploidi di interesse. I terreni selettivi dipendono dai genotipi del donatore, dai ceppi accettori e dalla costruzione mitocondriale prevista. Tuttavia, in generale, il ragionamento per la scelta del terreno selettivo è: i) dopo l’incubazione/recupero, la miscela di citoduzione viene coltivata su un terreno selettivo dove il ceppo parentale donatore non può crescere. Nell’esempio specifico nella Figura 4A, B, il donatore (ceppo sintetico di Rho⁾ trasporta l’allele ade2 non funzionale. Pertanto, la miscela di citoduzione deve essere incubata su una piastra media priva di adenina. Questa è la targa principale. ii) Una volta che le colonie crescono, la piastra master viene replicata nuovamente su un terreno privo di adenina (per generare una nuova piastra master da cui verranno purificate le colonie positive di interesse) e, successivamente, su un terreno in cui possono crescere solo i diploidi. Ciò è necessario per evitare un’ulteriore purificazione involontaria delle colonie diploidi. Nel caso dell’esempio della Figura 4C, solo i diploidi possono crescere su terreni privi di leucina. iii) La piastra master viene anche replicata su terreni dove cresceranno solo quegli aploidi accettori che incorporano il DNA mitocondriale di interesse. Nell’esempio della Figura 4C, gli aploidi crescono su mezzi respiratori contenenti etanolo/glicerolo come fonte di carbonio poiché la proteina Cox1ΔC15 è funzionale. Il ceppo rho⁺ risultante che portava il mtDNA di interesse è stato chiamato XPM209²⁵. I ceppi utilizzati nella Figura 2 e nella Figura 4 sono elencati nella Tabella 1.

Figura 2: Diagramma che descrive un esempio specifico di trasformazione mitocondriale e selezione di cellule rho^– -positive positive. (A) La modifica intenzionale del genoma mitocondriale era una delezione della regione che codifica per gli ultimi 15 amminoacidi della subunità Cox1 (Cox1ΔC15). (B) I WP sono stati rivestiti con due plasmidi per trasformare le cellule di lievito. Uno era il plasmide Yep352 a 2 μ che era diretto ed espresso nel nucleo. L’altro era il plasmide pXPM61, che contiene l’allele COX1ΔC15 più 395 nt e 990 nt dei COX1 5′ e 3′-UTR, rispettivamente. (C) I WP sono stati introdotti in cellule del ceppo NAB69, che manca di DNA mitocondriale (ceppo rho⁰ ). Le colonie di trasformanti ottenute dalle piastre di bombardamento sono state replicate su un mezzo privo di uracile, il marcatore auxotrofico del plasmide nucleare YEp352. (D) Per selezionare le colonie rho^– positive, la piastra -URA è stata replicata su un terreno privo di uracile. Questa era la piastra principale da cui venivano raccolte e isolate le colonie positive. È stato anche replicato su piastre con rich media (YPD) e un prato di un ceppo tester. Durante l’accoppiamento, il ^DNA mitocondriale sintetico è stato ricombinato con il DNA mitocondriale del ceppo tester, L45²⁷, che porta una mutazione nel gene COX1 (D369N). I diploidi che crescevano sui mezzi respiratori contenevano il DNA trasformato. Le colonie corrispondenti venivano prelevate dalla piastra principale per riposarle e purificarle. Per aiutare a identificare le colonie positive nella piastra principale in tutte le repliche di placcatura, sono stati fatti dei segni con un pennarello indelebile sui bordi delle piastre (linee verdi). (E) Le colonie positive selezionate sono state conservate su un terreno privo di uracile. Questa era la nuova targa principale. Come in D, sono stati effettuati altri due cicli di test per purificare le colonie di rho^– sintetiche. Abbreviazioni: WPs = particelle di tungsteno; mtDNA = DNA mitocondriale; -URA/Sorb = privo di uracile/ contenente Sorbitolo; WT = tipo selvaggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Diagramma che descrive la procedura di citoduzione. (A) Panoramica generale su come le cellule si accoppiano durante la citoduzione. Durante la citoduzione, i mitocondri dei ceppi donatore e accettore si fondono in modo che il DNA mitocondriale di entrambi i ceppi si ricombini. Poiché la fusione nucleare è ridotta a causa della mutazione kar1-1 ³⁰, si formano zigoti binucleari. Dopo un certo periodo di incubazione/recupero, vengono selezionate le gemme di zigoti binucleari e gli accettori aploidi contenenti la mutazione mitocondriale intenzionale. (B) L’accoppiamento del ceppo sintetico rho^– (donatore) e del ceppo accettore attraverso la citoduzione permette la formazione di shmoos (frecce rosse), una forma caratteristica del lievito di accoppiamento. L’immagine è stata scattata al microscopio ottico con un obiettivo 100x. Barra della scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Diagramma che descrive un esempio specifico di citoduzione per integrare la mutazione COX1ΔC15 nel genoma mitocondriale. (A) Le colture liquide del ceppo sintetico rho^– (donatore, XPM199) e del ceppo di interesse (accettore, XPM10) sono state mescolate per accoppiarsi. Dopo la formazione dello shmoo, la miscela è stata recuperata in una coltura liquida per 2-4 ore. Successivamente, la miscela di citoduzione è stata spalmata su una piastra con un terreno privo di adenina per prevenire la crescita delle cellule del donatore. (B) Rappresentazione schematica degli eventi di ricombinazione del DNA mitocondriale dal donatore (XPM199) e dall’accettore (XPM10) durante la citodottazione. (C) La piastra master è stata replicata su diversi terreni selettivi per identificare e purificare quegli aploidi che integravano il gene mitocondriale previsto nel DNA dell’organello (XPM209)²⁵. Abbreviazioni: -ADE = carente di adenina; -LEU = carente di leucina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.