Este protocolo proporciona una técnica para cosechar y cultivar ganglios de raíz dorsal explantados (DRG) de ratas Sprague Dawley adultas en un dispositivo multicompartimento (MC).
La característica neuronal periférica más común del dolor es un umbral de estimulación disminuido o hipersensibilidad de los nervios terminales de los ganglios de la raíz dorsal (DRG). Una de las causas propuestas de esta hipersensibilidad está asociada a la interacción entre las células inmunitarias del tejido periférico y las neuronas. Los modelos in vitro han proporcionado conocimientos fundamentales para comprender cómo estos mecanismos dan lugar a la hipersensibilidad de los nociceptores. Sin embargo, los modelos in vitro se enfrentan al reto de trasladar la eficacia a los humanos. Para abordar este desafío, se ha desarrollado un modelo in vitro fisiológica y anatómicamente relevante para el cultivo de ganglios de raíz dorsal intactos (DRG) en tres compartimentos aislados en una placa de 48 pocillos. Los DRG primarios se extraen de ratas Sprague Dawley adultas después de la eutanasia humanitaria. Se recorta el exceso de raíces nerviosas y el DRG se corta en tamaños apropiados para el cultivo. A continuación, los GRD se cultivan en hidrogeles naturales, lo que permite un crecimiento robusto en todos los compartimentos. Este sistema multicompartimentado ofrece un aislamiento anatómicamente relevante de los cuerpos celulares DRG de las neuritas, los tipos de células fisiológicamente relevantes y las propiedades mecánicas para estudiar las interacciones entre las células neuronales e inmunitarias. Por lo tanto, esta plataforma de cultivo proporciona una herramienta valiosa para investigar las estrategias de aislamiento del tratamiento, lo que en última instancia conduce a un mejor enfoque de detección para predecir el dolor.
El dolor crónico es la principal causa de discapacidad y pérdida de trabajo en todo el mundo1. El dolor crónico afecta a alrededor del 20% de los adultos en todo el mundo e impone una carga social y económicasignificativa 2, con costos totales estimados entre $560 y $635 mil millones cada año en los Estados Unidos3.
La principal característica periférica que presentan los pacientes con dolor crónico es la disminución del umbral de estimulación de los nervios, lo que hace que el sistema nervioso responda mejor a los estímulos 4,5. La disminución del umbral de estimulación puede dar lugar a una respuesta dolorosa a un estímulo previamente no doloroso (alodinia) o a una respuesta intensificada a un estímulo doloroso (hiperalgesia)6. Los tratamientos actuales para el dolor crónico tienen una eficacia limitada, y los tratamientos que tienen éxito en modelos animales a menudo fracasan en los ensayos en humanos debido a las diferencias mecanicistasen la manifestación del dolor. Los modelos in vitro que pueden imitar con mayor precisión los mecanismos de sensibilización periférica tienen el potencial de aumentar la traducción de nuevas terapias 8,9. Además, al modelar aspectos clave de los nervios sensibilizados en un sistema de cultivo, los investigadores podrían desarrollar una comprensión más profunda de los mecanismos que impulsan los umbrales más bajos e identificar nuevos objetivos terapéuticosque los reviertan.
Las plataformas in vitro o sistemas microfisiológicos ideales incorporarían la separación física de las neuritas distales y el cuerpo de las células de los ganglios de la raíz dorsal (DRG), un entorno celular tridimensional (3D) y la presencia de células de soporte nativas para imitar de cerca las condiciones in vivo . Sin embargo, un trabajo reciente de Caparaso et al.11 muestra que las plataformas actuales de cultivo de DRG carecen de una o más de estas características clave, lo que las hace insuficientes para replicarse en condiciones in vivo . Aunque estas plataformas son fáciles de instalar, no imitan la base biológica de la sensibilización periférica y, por lo tanto, es posible que no se traduzcan en eficacia in vivo . Para abordar esta limitación, se ha desarrollado un modelo in vitro fisiológicamente relevante para el cultivo de ganglios de la raíz dorsal (DRG) dentro de una matriz de hidrogel con tres compartimentos aislados para permitir el aislamiento fluídico temporal de neuritas y cuerpos celulares DRG11. Este modelo ofrece relevancia tanto fisiológica como anatómica, que tiene el potencial de estudiar la sensibilización periférica de las neuronas in vitro.
El creciente interés en el uso de explantes de DRG en un cultivo 3D se debe a su capacidad para facilitar el crecimiento robusto de neuritas, lo que sirve como un indicador indirecto de la viabilidad de DRG12. Si bien los explantes primarios de DRG neonatales o embrionarios se utilizan predominantemente en las plataformas actuales de cultivo in vitro 13,14, el uso de explantes de roedores adultos proporciona un mejor modelo de la fisiología neuronal madura, que imita de cerca la fisiología humana de DRG en comparación con los explantes de roedores neonatos o embrionarios15. Los explantes de DRG se refieren a la preservación del tejido celular y molecular del tejido nativo de DRG, principalmente mediante el mantenimiento de células de soporte nativas no neuronales. En este documento, se describe la metodología para cosechar y cultivar explantes de DRG de ratas Sprague Dawley adultas en un dispositivo multicompartimento (MC) (Figura 1).
Se ha demostrado eficacia en el cultivo de GRD de la columna cervical, torácica y lumbar sin diferencias observables en el crecimiento de neuritas. Para esta aplicación, el objetivo era provocar el crecimiento de neuritas en los compartimentos exteriores del dispositivo; por lo tanto, este artículo no discriminó entre los niveles de GRD. Sin embargo, si es necesario para un experimento específico, el nivel de DRG se puede adaptar para satisfacer las necesidades de los experimentadores. Actualmente existen otros modelos de cultivo compartimentados para el cultivo 3D de DRGs16, sin embargo, estos dispositivos no contienen células de soporte no neuronales nativas preservadas, lo que puede limitar la traducción. La preservación de la estructura nativa de las DRG recolectadas es importante porque asegura la retención de las células de soporte no neuronales, cuyas interacciones con las neuronas DRG son esenciales para mantener las propiedades funcionales de estas neuronas. Varios estudios co-cultivaron DRGs disociadas con células neuronales no nativas, como las células de Schwann, para promover la mielinización de las neuronas 17,18,19.
Este protocolo describe un método para cosechar DRG adultos de Sprague Dawley y cultivarlos en hidrogeles naturales 3D. A diferencia de este método, otros enfoques para recolectar GRD de ratones y ratas implican el aislamiento de la columna vertebral. La columna vertebral extirpada se divide a la mitad y se extirpa la médula espinal para exponer los GRD 23,24,25. El daño a la médula espinal limita el suministro de sangre, l…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo contó con el apoyo de una beca de la NSF (2152065) y un premio NSF CAREER (1846857). Los autores desean agradecer a todos los miembros actuales y pasados del Laboratorio Wachs por contribuir a este protocolo. Los diagramas de la Figura 1 se realizaron en Biorender.
#5 forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | For trimming and cutting DRG |
10x DMEM | MilliporeSigma | D2429 | |
1x PBS (autoclaved) | Prepared in lab | 7.3 – 7.5 pH | |
24 well plates | VWR | 82050-892 | To temporarily store harvested and cut DRGs |
3 mL Syringe sterile, single use | BD | 309657 | |
48 well plates | Greiner Bio-One | 677180 | |
60 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713A | To hold media for trimming and cutting |
Aluminium foil | Fisherbrand | 01-213-104 | |
B27 Plus 50x | ThermoFisher | 17504044 | For DRG media |
Collagen type I | Ibidi | 50205 | |
Curved cup Friedman Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16221-14 | For dissection |
Dumont #3 forceps | Fine Science Tools | 11293-00 | For dissection |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | For DRG media |
Form cure | Form Labs | curing agent | |
Form wash | Form Labs | To wash excess resins off MC | |
Glass bead sterilizer | Fisher Scientific | NC9531961 | |
Glass vials (8 mL) | DWK Life Sciences (Wheaton) | 224724 | |
GlutaMax | ThermoFisher | 35050-061 | For DRG media |
HEPES (1M) | Millipore Sigma | H0887 | |
High temp V2 resin | FormLabs | FLHTAM02 | |
Hyaluronic Acid Sodium Salt | MilliporeSigma | 53747 | Used to make MAHA |
Irgacure | MilliporeSigma | 410896 | |
Laminin | R&D Systems | 344600501 | |
Large blunt-nose scissors | Militex | EG5-26 | For dissection |
Large forceps (serrated tips) | Militex | 9538797 | For dissection |
Large sharp-nosed scissors | Fine Science Tools | 14010-15 | For dissection |
Low Retention pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-017 | For pipetting collagen and MAHA |
Methacrylated hyaluronic acid (MAHA) | Prepared in lab | N/A | 85 – 115 % methacrylation |
Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 556-NG-100 | For DRG media |
Neurobasal A Media | ThermoFisher | 10888022 | For DRG media |
Parafilm | Bemis | PM996 | |
Parafilm | Bemis | PM996 | |
Penicillin/Streptomycin (PS) | EMD Millipore | 516106 | For DRG media |
pH test strips | VWR International | BDH35309.606 | |
Pipette tips (1000 µL) | USA Scientific | 1111-2021 | |
Preform 3.23.1 software | Formslab | To upload STL file | |
Rat | Charles River | ||
Resin 3D printer | Form Labs | Form 3L | 3D printing MC device |
Small sharp-nosed scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | For dissection |
Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | S6014 | |
Straight cup rongeur | Fine Science Tools | 16004-16 | For dissection |
Straight edge spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | For dissection |
Surgical Scaplel blade (No. 10) | Fisher Scientific | 22-079-690 | |
Syring filters, PES (0.22 µm) | Celltreat | 229747 | |
Tiny spring scissors | World Precision Instruments | 14003 | For trimming and cutting DRG |
UV lamp | Analytik Jena US | To photocrosslink hydrogel (15 – 18 mW/cm2) |