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Medio ambiente

Inoculation et observation de cultures mycorhiziennes arbusculaires sur des systèmes autotrophes à base de polymères superabsorbants

Published: June 14, 2024
doi:
10.3791/66848
, ,
1Centre d’Étude de la Forêt (CEF) and Institut de Biologie Intégrative et des Systèmes (IBIS),Université Laval, 2Ottawa Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada

Summary

Ici, nous décrivons une technique simple et peu coûteuse pour inoculer et observer les champignons mycorhiziens arbusculaires dans des systèmes autotrophes à base de polymères superabsorbants.

Abstract

Les champignons mycorhiziens arbusculaires (MA) sont difficiles à manipuler et à observer en raison de leur association permanente avec les racines des plantes et de leur propagation dans la rhizosphère. En règle générale, les champignons AM sont cultivés dans des conditions in vivo en culture en pot avec un hôte autotrophe ou dans des conditions in vitro avec des racines transformées par transfert d’ADN Ri (hôte hétérotrophe) dans une boîte de Pétri. De plus, la culture des champignons AM en culture en pot se fait dans un environnement opaque et non stérile. En revanche, la culture in vitro implique la propagation de champignons AM dans un environnement stérile et transparent. Le système autotrophe à base de polymères superabsorbants (SAP-AS) a récemment été développé et il a été démontré qu’il combinait les avantages des deux méthodes tout en évitant leurs limitations respectives (opacité et hôte hétérotrophe, stérilité). Ici, nous présentons un protocole détaillé pour une préparation facile, l’inoculation d’une seule spore et l’observation des champignons AM dans SAP-AS. En modifiant les boîtes de Pétri, des observations photographiques et vidéo à haute résolution ont été possibles sur des spécimens vivants, ce qui aurait été difficile voire impossible avec les techniques in vivo et in vitro actuelles.

Introduction

Les champignons mycorhiziens arbusculaires (Glomeromycotina) sont d’anciens symbiotes racinaires de plantes (~500 Ma,1,2) qui ont peut-être joué un rôle essentiel dans la colonisation des sols terrestres par les trachéophytes. Cette longue coévolution entre les champignons AM et les trachéophytes place la mycorhize arbusculaire comme un chef-d’œuvre du mutualisme interrègne. Les hyphes fongiques AM augmentent considérablement la capacité de l’hôte à chercher des nutriments dans le sol3, y compris le transfert de nutriments vers de nouveaux hôtes via des réseaux mycorhiziens4. Le réseau d’hyphes améliore la structure du sol, et la production de glomaline pourrait réduire l’érosion des sols5. Le transfert d’une partie du carbone atmosphérique vers le symbiote fongique des racines augmente la séquestration du carbone dans le sol6. Dans l’ensemble, les champignons AM améliorent la résilience des plantes aux stress abiotiques et biotiques et ont donc fait l’objet d’une attention considérable en agroécologie7. En effet, les pratiques de gestion agricole favorables aux champignons ont le potentiel de réduire l’utilisation d’intrants chimiques pour la production agricole et d’améliorer la teneur en carbone organique du sol, qui sont des objectifs importants que les agriculteurs doivent intégrer dans leurs pratiques de gestion afin de respecter les engagements nationaux et internationaux concernant la transition vers des pratiques agricoles durables et la lutte contre le changement climatique.

Cependant, les champignons AM sont des champignons microscopiques du sol, et leur étude est difficile en raison de leur biotrophie obligatoire et de la distribution de la rhizosphère. Le sol est l’un des biotopes les plus difficiles à étudier en raison de son opacité, de l’immense diversité de niches et des interactions multitrophiques à toutes les échelles. L’isolement, la propagation et la caractérisation des champignons MA sont donc difficiles. Jusqu’au milieu du 20ème siècle, seules les espèces fongiques AM formant des sporocarpes avaient été caractérisées8. Cependant, la majorité des espèces fongiques AM produisent des spores non sporocarpiques allant de ~20 μm à ~500 μm de diamètre. La description de la technique de tamisage humide du sol9 a ouvert la voie à la description de ces espèces fongiques MA, et le taux de description des espèces a augmenté depuis lors. Néanmoins, les champignons AM représentent un petit groupe d’espèces par rapport aux Dikarya.

Les cultures pièges, c’est-à-dire l’inoculation de spores ou d’un échantillon de sol environnemental contenant des spores fongiques de MA d’un pot rempli de matériel autoclavé tel que du turface et de la vermiculite et d’une graine stérilisée d’un hôte (poireau, plantain), est une façon de propager les champignons MA dans des conditions contrôlées10. Cependant, le succès de l’inoculation ne peut être évalué qu’en recherchant la présence d’arbuscules dans les fragments de racines après coloration ou en tamisant par voie humide un sous-échantillon ou le pot entier pour isoler les spores. Il est généralement recommandé de ne pas perturber le système pendant au moins 6 à 12 semaines avant l’analyse de la culture en pot. Cette technique de culture convient à la propagation de la plupart des espèces fongiques AM connues, mais l’observation en direct du symbiote fongique n’est pas possible et le succès de l’inoculation est incertain, en particulier lorsque des cultures de spores uniques sont tentées.

Au contraire, la propagation in vitro des champignons AM peut être suivie en vivant grâce à la transparence du milieu de culture11, mais cette technique de culture nécessite la disponibilité de racines transformées et la présence de carbone dans le milieu de culture pour travailler dans un environnement stérile. Les spores doivent être stérilisées et, avec l’association avec un hôte hétérotrophe, la plupart des espèces fongiques AM connues ne sont pas propagées avec succès à l’aide de cette technique.

Par conséquent, la propagation des champignons MA à l’aide des techniques actuelles, bien qu’établies et largement utilisées dans la plupart des laboratoires, présente certaines limites pour l’étude des champignons MA. Paré et al. (2022)12 ont mis au point une technique in vivo utilisant un polymère superabsorbant transparent (SAP) en combinaison avec des plantes entières pour propager des champignons MA. La technique, conçue comme un système autotrophe basé sur SAP (SAP-AS), est simple et peu coûteuse et combine les avantages de la culture en pot (association avec un hôte autotrophe, conditions non stériles) et des cultures in vitro (milieu transparent, suivi en direct du développement de la symbiose). Ici, nous présentons un protocole expliquant comment mettre en place les cultures avec l’inoculation d’une seule spore et utiliser le SAP-AS pour l’observation à fort grossissement du mycélium extraradical. Plus précisément, nous décrivons comment modifier les boîtes de Pétri à deux compartiments, préparer la solution nutritive, préparer le polymère superabsorbant (SAP), préparer les semis, assembler le SAP-AS et inoculer avec une seule spore, faire prégermer les spores et surveiller en direct le développement de la symbiose.

Protocol

1. Modification des boîtes de Pétri à deux compartiments REMARQUE : Les matériaux requis pour cette étape sont répertoriés dans le tableau des matériaux. Modifiez le couvercle de la boîte de Pétri.À l’aide de l’outil rotatif et d’un foret approprié, percez deux trous (~7 mm de diamètre) dans le haut du couvercle et une ouverture de 1 cm sur le côté. Un trou sera utilisé pour irriguer le compartiment racinaire (vermiculite) et l’autre pour le compartiment des hyphes (SAP). Modifiez le fond de la boîte de Pétri.Percez une encoche sur le côté du fond de la boîte de Pétri pour la tige de la plante à l’aide de l’outil rotatif électrique. Assurez-vous que l’encoche n’est pas trop profonde pour éviter que le liquide ne s’écoule. Cette encoche s’alignera avec l’ouverture de 1 cm du couvercle (étape 1.1). Pour remplacer la barrière en plastique de la boîte de Pétri à deux compartiments par la membrane filtrante en maille de nylon, utilisez l’outil rotatif électrique pour percer une encoche rectangulaire de 30 mm jusqu’au bas de la boîte de Pétri. Pour une observation à haute résolution, percez des trous circulaires de ~25 mm de diamètre dans le fond de la boîte de Pétri. Selon les besoins, faites un seul trou (ou plusieurs trous) du côté SAP ou un dans chaque compartiment. Assurez-vous que les trous ne sont pas percés directement sous les trous d’irrigation du couvercle. Installez la membrane filtrante en maille de nylon.À l’aide du guide métallique et du trombone, calez le morceau de la membrane filtrante en nylon et appuyez fermement sur la barrière en plastique. Alignez le haut de la membrane avec le haut de la barrière en plastique. Assurez-vous que la membrane dépasse du bas du guide. À l’aide du kit de pyrogravure, coupez le long du bord du guide métallique pour faire fondre et sceller la membrane au fond de la boîte de Pétri et à la barrière en plastique séparant les deux compartiments. Avec le guide métallique et le trombone toujours en place, retirez soigneusement l’excès de membrane filtrante en nylon à l’aide d’une pince à épiler. Vérifiez au microscope de dissection que la membrane filtrante en maille de nylon est correctement scellée au plastique pour empêcher la pénétration des racines dans le compartiment des hyphes (SAP). Installez la lamelle.REMARQUE : La lamelle est placée sous la boîte de Pétri. Cela permet d’utiliser l’huile d’immersion et de nettoyer la lamelle.Placez le mastic silicone le long du bord des trous circulaires (à l’extérieur du fond de la boîte de Pétri). Placez la lamelle à l’extérieur du fond de la boîte de Pétri et appuyez doucement pour assurer une adhérence parfaite. Laisser sécher et enlever l’excédent de mastic à l’aide d’une lame de rasoir. Inspectez et nettoyez.Utilisez un jet d’air pour enlever toute poussière ou morceaux de plastique qui auraient pu adhérer à la boîte de Pétri. Inspectez au microscope à dissection pour identifier et corriger tout défaut.REMARQUE : Portez des gants pour éviter les empreintes digitales sur les boîtes de Pétri 2. Préparation de 1 L de solution nutritive mMS-1 Préparez des solutions mères.Macronutriments : Peser et dissoudre les éléments suivants dans 1 L d’eau distillée :7,31 g de MgSO4·7 H2O, 0,80 g de KNO3, 0,65 g de KCl et 0,048 g de KH2PO4,. Peser 2,88 g de Ca(NO3)2·4H2O et dissoudre dans 1 L d’eau distillée. Peser 0,80 g de NaFeEDTA et dissoudre dans 0,5 L d’eau distillée. Peser 0,375 g de KI et dissoudre dans 0,5 L d’eau distillée. MicronutrimentsDissoudre 3 g de MnCl2·4H2O dans 100 mL d’eau distillée. Dissoudre 1,325 g de ZnSO4·7H2O dans 100 mL d’eau distillée. Dissoudre 0,75 g de H3BO3 dans 100 ml d’eau distillée. Une fois dissoutes, mélanger les solutions préparées aux étapes 2.1.5.1 à 2.1.5.3. Peser 0,65 g de CuSO4·5H2O et dissoudre dans 50 mL d’eau distillée. Dissoudre 0,12 g de Na2MoO4·2H2O dans 100 mL d’eau distillée. Ajouter 5 mL de la solution de l’étape 2.1.5.5 et 1 mL de l’étape 2.1.5.6 à la solution de l’étape 2.1.5.4. Ajuster le volume de la solution obtenue à l’étape 2.1.5.7 à 500 mL avec de l’eau distillée. Préparez 1 L de support mMS-1.Ajouter 700 ml d’eau distillée dans une bouteille en verre de 2 L. Tout en agitant constamment à l’aide d’une barre magnétique, ajouter 100 mL de solution de macronutriments (étape 2.1.1), 100 mL de solution de nitrate de calcium (étape 2.1.2), 5 mL de solution d’EDTA ferrique (étape 2.1.3), 1 mL de solution de KI (étape 2.1.4) et 1 mL de solution de micronutriments (étape 2.1.5). Ajustez le volume de la solution à 1000 mL.NOTE : mMS-1 est adapté de Bécard et Fortin (1988)14. La stérilisation à 121 °C pendant 15 min est facultative car le SAP-AS n’est pas stérile. Le pH n’est pas ajusté parce que le SAP a un fort effet tampon, et Paré et al. (2022)12 ont montré que les conditions sur le SAP étaient relativement neutres (6,7 à 7,4). 3. Préparation de SAP REMARQUE : Les matériaux requis pour cette étape sont répertoriés dans le tableau des matériaux. Hydrater le SAP : mélanger 5 g de SAP sec avec 500 mL de solution nutritive mMS-1 (étape 2.2). Laisser hydrater pendant 12 h (toute la nuit) à température ambiante (RT). Égouttez et récupérez les grains de SAP hydratés.Lorsque du SAP hydraté est utilisé pour remplir la plaque de 12 puits (section 7), ne pas égoutter le SAP hydraté et mélanger le grain hydraté et le reste de la solution nutritive mMS-1.REMARQUE : Trois granulométries du SAP sec sont disponibles : petite, moyenne et grande. La granulométrie moyenne (1-2 mm) est la plus appropriée. Le SAP de la grande granulométrie avale trop lorsqu’il est hydraté et le couvercle de la boîte de Pétri ne peut pas être fermé, tandis que le SAP de la petite granulométrie laisse peu d’espace entre eux, ce qui est une limitation pour l’observation de la structure fongique entre les grains. 4. Préparation des plants REMARQUE : Les matériaux requis pour cette étape sont répertoriés dans le tableau des matériaux. Faire germer les graines de P. lanceolata sur du papier buvard imbibé d’une solution nutritive mMS-1 dans une boîte de Pétri. Incuber dans l’obscurité à RT. Réhydratez au besoin jusqu’à ce que les radicelles mesurent au moins 2 cm de long. 5. Montage et gestion de SAP-AS REMARQUE : Les matériaux requis pour cette étape sont répertoriés dans le tableau des matériaux. Assemblez SAP-AS (étape 1 + étape 2 + étape 3 + étape 4)Placez la tige du semis dans l’encoche sur le côté de la boîte de Pétri avec la racine vers l’intérieur et les cotylédons/feuilles et tiges vers l’extérieur. Couvrez les racines avec environ 1,5 à 2 g de vermiculite. Hydratez le compartiment racinaire avec 8 mL de solution nutritive mMS-1. Cela aidera à stabiliser la racine et la vermiculite. Ajoutez 5 g de SAP hydraté le long de la membrane filtrante en nylon sur le côté du compartiment racinaire. Ajouter 15 g de SAP hydraté dans le compartiment hyphal. Le compartiment hyphe est le compartiment sans encoche sur le côté du fond de la boîte de Pétri. Avant de fermer la boîte de Pétri avec le couvercle, assurez-vous que les encoches latérales du couvercle et le fond de la boîte de Pétri sont alignés afin de ne pas endommager la tige. Fermez la boîte de Pétri avec une bande de paraffine qui relie la base et le couvercle, en prenant soin de ne pas écraser la jeune tige. Pesez et notez le poids moyen de la boîte de Pétri pour déterminer quand le SAP-AS doit être réhydraté. Empilez les boîtes de Pétri pour optimiser l’espace. Gardez la boîte de Pétri dans l’obscurité à l’aide d’un couvercle opaque avec une ouverture sur le côté pour les semis. Gérez SAP-AS.Hydratez les boîtes de Pétri avec la solution nutritive mMS-1 uniquement. Utilisez le poids moyen comme référence. Lorsque la boîte de Pétri s’est allégée de 5 à 6 g, ajoutez la solution nutritive mMS-1 pour la ramener à son poids d’origine. Assurez-vous que la vermiculite et le SAP sont hydratés mais non inondés. Les racines doivent avoir accès à l’oxygène. Au fur et à mesure que le semis et son partenaire fongique se développent, irriguez-les plus fréquemment. Il n’est pas nécessaire d’arroser les deux compartiments en même temps. Les besoins en irrigation varient en fonction du développement des semis, mais aussi en fonction des conditions environnementales dans lesquelles les SAP-AS sont incubés. Réduisez les besoins d’irrigation en enlevant les vieilles feuilles si la plante a plus de trois feuilles saines. Retirez les feuilles mortes.REMARQUE : La présence de cations tels que K+, Mg2+ et Ca2+ dans la solution nutritive mMS-1 tend à diminuer l’expansion du réseau SAP13 au fil du temps. 6. Inoculation du SAP-AS avec une seule spore REMARQUE : Les matériaux requis pour cette étape sont répertoriés dans le tableau des matériaux. Inoculer avec une seule spore.Chauffez la pipette en verre avec une bougie à flamme ou un bec Bunsen. Tirez pendant que le verre fond pour étirer le tube de verre jusqu’à ce qu’il se sépare. Sous un stéréomicroscope, cassez la pointe de la pipette en verre pour réduire le diamètre interne (généralement 100-300 μm). Cela facilitera grandement la manipulation des spores individuelles. Ouvrez la boîte de Pétri, localisez l’endroit où la spore doit être placée et dégagez un espace parmi les 5 g de SAP hydraté le long de la membrane filtrante en nylon pour exposer une section d’une racine. Sous le microscope de dissection, prélevez une spore à l’aide de la pipette extrudée. Pipetez un peu de liquide avant de pipeter la spore. Évitez de pipeter le liquide après avoir recueilli la spore. Sous le microscope à dissection, déposez soigneusement la spore sur la racine. Le liquide pipeté avant le pipetage de la spore aidera à expulser la spore. Si la spore n’est pas déposée à un endroit optimal, utilisez une aiguille d’acupuncture ou brossez les poils pour remettre la spore en contact avec la racine. Si nécessaire, prenez une photo de la spore déposée sur la racine pour référence et utilisez un marqueur pour localiser le site d’inoculation. Remplacez le SAP sur le fragment racine pour fournir un microenvironnement humide pour la racine et les spores. Attendez au moins 24 h avant d’irriguer le compartiment racinaire et veillez à ne pas laver les spores de la racine. Avant de fermer la boîte de Pétri avec le couvercle, assurez-vous que les encoches latérales du couvercle et le bas de la boîte de Pétri sont alignés afin de ne pas endommager la tige du plantule.REMARQUE : Le SAP-AS est prêt à être inoculé lorsque les racines atteignent la membrane filtrante à mailles de nylon, idéalement quelques jours après l’irrigation, de sorte qu’il n’y a pas de liquide libre. 7. Germination des spores sur SAP (facultatif) REMARQUE : Les matériaux requis pour cette étape sont répertoriés dans le tableau des matériaux. Germination des spores.Mélangez le SAP hydraté pour obtenir une texture lisse (voir étape 3.3.1). Les bulles d’air disparaissent généralement en 24 heures ou par autoclave (facultatif) du SAP mélangé. À l’aide d’une seringue de 20 mL sans aiguille, pipeter environ 2 g (l’équivalent de 2 mL) de SAP mélangé dans chaque puits de la plaque à 12 puits. Sélectionnez une spore sous le microscope de dissection et utilisez la pipette extrudée comme décrit dans la section 6. Sous le microscope à dissection, placez une spore au centre de chaque puits. Incuber la plaque de 12 puits dans l’obscurité à RT et surveiller la germination périodiquement. Sous le microscope de dissection, sélectionnez une spore avec un hyphe en croissance (d’au moins quelques millimètres de longueur). Ajoutez 1 mL de solution nutritive mMS-1 dans le puits et attendez quelques minutes que le milieu devienne plus fluide. Si nécessaire, utilisez l’aiguille d’acupuncture pour retirer délicatement les spores et les hyphes du substrat. Prélever la spore soit à l’aide d’une pipette, soit en ramenant les racines d’un semis à la surface du milieu afin de coller la spore et les hyphes aux racines. Ensuite, placez le plant dans la boîte de Pétri comme décrit à l’étape 5.1.3.REMARQUE : Coordonner la germination des spores et la croissance des semis. Cette méthode n’a été testée qu’avec des spores de R. irregularis . 8. Suivi en direct du développement de la symbiose REMARQUE : Les matériaux requis pour cette étape sont répertoriés dans le tableau des matériaux. Observez régulièrement avec un microscope à dissection, droit ou inversé.Observez le haut de chaque compartiment à 20x – 40x à l’aide d’un microscope à dissection avec éclairage blanc et fond sombre. S’il n’y a pas de microscope inversé, observez le bas de chaque compartiment à l’aide d’un microscope à dissection ou d’un microscope droit en inversant la boîte de Pétri. Avant d’inverser la boîte de Pétri, laissez sécher le SAP-AS pendant 2 jours afin que le SAP adhère légèrement au fond de la boîte de Pétri. Faites des observations détaillées à 40x à travers le fond de la boîte de Pétri et jusqu’à 100x (immersion dans l’huile) à travers la lamelle. Observez les spores et les réseaux d’hyphes.REMARQUE : Les structures fongiques qui se développent à l’intérieur des grains de SAP peuvent être colorées.Préparez une solution d’encre et de vinaigre selon Vierheilig et al. (1998)15. Ne pas chauffer. Extrayez un grain SAP contenant des hyphes et des spores et placez-le dans l’encre à RT. L’encre pénétrera dans le grain SAP et tachera les hyphes et les spores en quelques minutes. Retirez le grain SAP et placez-le dans une solution nutritive mMS-1 ou dans de l’eau du robinet. L’encre sortira du grain dans les 12 heures, mais les spores et les hyphes resteront tachés. Appuyez sur le grain SAP entre deux lames de microscope pour l’aplatir pour la photographie et le comptage des spores. Observez les arbuscules.Extrayez quelques racines du compartiment racinaire et teignez à l’aide du protocole de l’encre et du vinaigre selon Vierheilig et al. (1998)15. Attention à ne pas immerger les racines dans la solution de KOH pendant plus de 2-3 min ; Sinon, les racines deviendront trop fragiles pour les étapes suivantes et se désintégreront en débris inutilisables. À l’aide d’un microscope à dissection, sélectionnez un fragment de racine d’environ 5 mm de long pouvant contenir des arbuscules et placez-le sur une lame dans une goutte d’eau. À l’aide d’aiguilles d’acupuncture ou d’une pince à épiler extrêmement fine, arrachez les racines en couches de quelques cellules d’épaisseur. Absorbez l’eau et vérifiez au microscope que les segments avec arbuscules sont toujours présents et de qualité satisfaisante, et correctement placés sur la lame. À ce stade, les arbuscules doivent être facilement visibles dans les couches de cellules racinaires. Laissez sécher pendant 2-3 minutes pour que les couches racinaires adhèrent à la lame. Ajoutez une goutte de tampon polyvinylique-acide lactique glycérol (PVLG) et ajoutez la lamelle. Observer par des méthodes de microscopie standard.

Representative Results

Le SAP-AS est une technique simple et peu coûteuse pour cultiver des champignons AM et observer le développement de structures fongiques intraradicalaires et extraradicales. Ici, nous avons fourni un protocole détaillé pour aider les utilisateurs à configurer SAP-AS et nous avons introduit deux modifications par rapport à la description originale de SAP-AS. Tout d’abord, la présence de SAP sur le compartiment racinaire le long de la membrane Nitex facilite l’inoculation du système avec une seule spore (Figure 1). Figure 1 : Inoculation d’une seule spore du SAP-AS. (A) Inoculation d’une seule spore de Rhizophagus irregularis. (B) Inoculation d’une seule spore de Funneliformis mosseae. Les flèches blanches indiquent le point d’inoculation. Barres d’échelle : 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Il est facile d’identifier une zone avec quelques racines où les spores peuvent se déposer. L’emplacement exact de la spore peut être marqué à la surface du couvercle de la boîte de Pétri et vérifié périodiquement pour la germination et la colonisation des racines. La présence de grains hydratés de SAP offre un environnement humide propice à la germination des spores. L’inoculation sur les racines à côté de la membrane Nitex permet un développement rapide de la symbiose avec le mycélium extraradicalaire pour accéder rapidement au compartiment hyphe et chercher des nutriments (Figure 2). La capacité d’observer si la spore unique placée au point d’inoculation germe ou non nous permet également d’identifier et d’éliminer les cultures infructueuses et de les remplacer. Deuxièmement, les lamelles au fond de la boîte de Pétri permettent une imagerie en direct à haute résolution de la symbiose AM-fongique (Figure 2B,C) et, en particulier, du flux cytoplasmique au sein du mycélium extraradical (Figure 2D). Figure 2 : SAP-AS inoculé. (A) SAP-AS inoculé avec une seule spore de Rhizophagus irregularis (DAOM 197198). La plante hôte est Plantago lanceolata. (B) Amas de spores observé à travers la lamelle dans le compartiment hyphale sous un stéréomicroscope. Barre d’échelle : 500 μm. (C) Photographie haute résolution de l’amas de spores observé à travers la lamelle sous un microscope optique à un grossissement de 10x. Barre d’échelle : 100 μm (D) Photographie haute résolution d’hyphes observées à travers la lamelle de recouvrement au microscope optique à un grossissement de 100x. Barre d’échelle : 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Les utilisateurs peuvent tenter de faire germer des spores fongiques de MA sur du SAP hydraté avec une solution nutritive mMS-1 pour garantir que les SA-SAP ne sont inoculées qu’avec des spores viables (figure 3). Cependant, cela n’a été testé qu’avec des spores commerciales de R. irregularis, et le succès de la germination des spores sur SAP hydraté avec une solution nutritive mMS-1 peut varier considérablement avec d’autres espèces fongiques AM. Figure 3 : Germination des spores de R. irregularis dans une plaque à 12 puits. Barre d’échelle : 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Enfin, comme le SAP-AS est une technique in vivo et non stérile de propagation de la CMA, la boîte de Pétri peut être manipulée sur le banc et ouverte pour échantillonner les racines colonisées, les spores libres ou les grains colonisés de SAP (Figure 4). Les structures fongiques intraradicalaires et extraradicalaires peuvent être colorées d’une manière similaire à la CMA propagée dans des cultures d’organes en pot ou racinaires (Figure 4C). Figure 4 : Structures fongiques AM extraradicalaires et intraradicalaires extraites du SAP-AS. (A) Spores libres de R. irregularis observées dans le compartiment racinaire. Barre d’échelle : 200 μm. (B) Spores de R. irregularis colorées dans le SAP. Barre d’échelle : 500 μm. (C) Fragments de racines colorés montrant les hyphes intraradicaux et les arbuscules. Barres d’échelle : 50 μm, 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure supplémentaire 1 : Comparaison de l’épaisseur des différents outils disponibles pour manipuler les spores fongiques de MA. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Figure supplémentaire 2 : SAP-AS empilés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

L’inoculation est l’étape la plus critique du protocole, et les pipettes Pasteur en verre extrudé se sont avérées être un excellent outil pour manipuler avec précision des spores uniques de champignons AM tout en préservant leur intégrité. Les pipettes Pasteur en verre extrudé sont facilement façonnées à l’aide de la flamme d’une bougie ou d’un bec Bunsen, et l’ouverture peut être ajustée au stéréomicroscope pour s’adapter à la taille de la spore pipetée. Il est important de manipuler les spores à l’aide d’outils adaptés à la taille de la spore fongique AM (figure supplémentaire 1) et d’inoculer le SAP-AS lorsque les racines de la plante hôte sont suffisamment longues pour atteindre la membrane Nitex où la spore se dépose.

Les SAP-AS sont faciles à adapter aux exigences de l’expérience. Des boîtes de Pétri plus grandes peuvent être utilisées, avec des compartiments multiples, pour surveiller, par exemple, l’interaction entre des souches étroitement apparentées ou entre différentes espèces de CMA ou pour modifier l’environnement chimique (pH) ou biologique (introduction de nématodes, de bactéries, de champignons). Diverses plantes hôtes mycotrophes peuvent également être utilisées pour fournir aux champignons AM des photosynthétisés. La solution nutritive mMS-1 a été dérivée de la recette du milieu minimal (M) décrite par Bécard et Fortin (1988)15 , moins le saccharose, les vitamines et la gélose bacto pour limiter les sources de carbone. Cependant, le SAP-AS peut être complété par diverses solutions nutritives, en fonction des objectifs de l’expérience.

La propagation des champignons AM dans le SAP-AS nécessite un arrosage régulier. Le volume limité de vermiculite et de SAP expose les racines et le champignon AM aux fluctuations de l’humidité, en particulier dans les boîtes de Pétri standard à deux compartiments (10 cm de diamètre). La capacité d’expansion et, par conséquent, la transparence des grains SAP diminuent avec le temps. En effet, la présence de cations issus de la solution nutritive limite progressivement l’expansion du réseau d’acrylate et nécessite le remplacement du SAP au bout de plusieurs mois. De plus, les algues vertes et les moisissures peuvent se développer au fil du temps si les boîtes de Pétri ne sont pas correctement protégées de la lumière ou trop arrosées.

À ce jour, sept espèces fongiques AM ont été cultivées avec succès dans le SAP-AS, ce qui est bien inférieur au nombre d’espèces fongiques AM pouvant être multipliées dans les cultures en pot. Cependant, les conditions biotiques et abiotiques dans le SAP-AS sont très similaires à celles des cultures en pot, et il est probable que d’autres espèces fongiques du MA devraient être en mesure de se propager dans le SAP-AS. L’inoculation directe des spores dans le SAP-AS fournit probablement des conditions environnementales plus proches de celles de la rhizosphère dans un sol naturel en raison de la présence d’exsudats racinaires et/ou de bactéries, si des spores/graines non stériles sont utilisées pour l’inoculation. Cette méthode doit être préférée à l’inoculation avec des spores germées. De plus, les conditions qui déclenchent la germination des spores dans les CMA sont encore mal comprises, de sorte que la solution nutritive SAP hydratée avec mMS-1 peut ne pas être adaptée aux spores germées d’autres espèces fongiques MA. La germination des spores sur SAP hydraté avec une solution nutritive mMS-1 a été testée afin de sélectionner spécifiquement des spores viables pour l’étape d’inoculation en utilisant uniquement l’inoculum de R. irregularis .

L’inoculation et le suivi du développement de la symbiose AM sont facilement réalisés dans SAP-AS. Les boîtes de Pétri modifiées à deux compartiments permettent la culture de différentes espèces fongiques AM. Paré et al.12 ont multiplié sept espèces différentes de CMA appartenant à six genres et trois familles. La modification des boîtes de Pétri à deux compartiments se fait facilement avec des outils peu coûteux. Le coût et la quantité de matériaux (vermiculite, SAP, pipette Pasteur, etc.) et de réactifs (mMS-1) nécessaires à la préparation et à la maintenance du SAP-AS sont limités, ce qui permet de gérer un grand nombre de SAP-AS à moindre coût. La possibilité d’empiler le SAP-AS réduit également considérablement l’empreinte des cultures fongiques AM par rapport aux cultures en pot. Par exemple, 50 SAP-AS (5 piles de dix) peuvent tenir sur une étagère de 1 m de long (figure supplémentaire 2). Ces caractéristiques font du SAP-AS une technique simple et peu coûteuse qui est compatible avec l’enseignement de la symbiose AM dans les cours de laboratoire au lycée ou au niveau du premier cycle dans les universités. Les grains colonisés de SAP peuvent être utilisés pour inoculer de nouvelles cultures de SAP-AS ou en pot.

La présence d’une lamelle à l’arrière du fond de la boîte de Pétri permet de photographier et de filmer à haute résolution les structures fongiques extraradicales. Le flux cytoplasmique peut être facilement étudié dans des conditions de vie très proches des conditions naturelles. Ceci est d’une grande importance pour l’étude des fonctions des champignons AM liées à leur mycélium (nutriments, transport de l’eau, structure du sol, etc.) et pour les études de la morphogenèse des hyphes.

Les CMA complètent leur cycle biologique dans les racines des plantes et dans la rhizosphère. L’étude des microorganismes du sol est complexe en raison de la difficulté inhérente à l’observation de l’environnement du sol. L’objectif principal du SAP-AS est de recréer un environnement aussi similaire que possible à la rhizosphère pour la propagation des champignons MA tout en conservant la capacité d’observer le développement des champignons MA dans les moindres détails. Parce que cela implique des conditions non stériles, la quantité de carbone disponible doit être limitée pour éviter la prolifération de micro-organismes saprotrophes. La connaissance du comportement des champignons AM dans la rhizosphère est encore extrêmement limitée, et le SAP-AS offre la possibilité de faire des comparaisons détaillées entre les espèces en ce qui concerne leur capacité à se nourrir dans l’environnement extraradical, leur production de spores et leur colonisation racinaire. Cela peut être encore compliqué par l’ajout d’interactions avec d’autres espèces du sol telles que les bactéries, les nématodes, les protistes et les agents pathogènes fongiques des racines, et la connaissance des interactions microbiote du sol peut être améliorée grâce au SAP-AS.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier les deux évaluateurs anonymes pour leurs suggestions. Le financement de cette recherche a été fourni par Agriculture et Agroalimentaire Canada (AAC) dans le cadre du projet J-002295 (Gestion et amélioration des collections biologiques d’AAC).

Materials

100 x 15 mm Stackable Bi-Plate Kord Valmark 1204U09 https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Petri-Dishes/_/100-x-15-mm-Stackable-Bi-Plate
12-well plate  Greiner Bio-one 665180 https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-culture-multiwell-plates/665180.html
18 mm round glass coverslips Fisher Scientific 12-545-100 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-cover-glasses-circles-11/12545100#?keyword=12-545-100
20 mL Syringe PP/PE without needle Millipore Sigma Z683620-100EA https://www.sigmaaldrich.com/CA/en/product/aldrich/z683620?utm_source=google&utm_medium=
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Acupuncture needle  Lierre A143-LP1-3075 https://www.lierre.ca/products/lierre-plus-acupuncture-needles-100pcs?gad
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Blotting paper FLINN  FB0678 https://www.flinnsci.ca/blotting-paper-12-x-19-pkg.-of-10/fb0678/
Commercial or scientific blender or kitchen hand blender kitchenaid KHBV53DG https://www.kitchenaid.ca/en_ca/countertop-appliances/hand-blenders/hand-blender-products/p.variable-speed-corded-hand-blender.khbv53dg.html 
Dremel 199 Carving Bit Dremel 2615000199 https://www.dremel.com/ca/en/p/199-2615000199
Dry SAP medium granulometry 1–2 mm HORTA-SORB MD 00810085242789 https://www.horticulturalalliance.com/product/horta-sorb-md-granule/
Feather Stainless-Steel Blades for Dissecting Knife Handles  Fisher Scientific 08-916-5B https://www.fishersci.ca/shop/products/graham-field-stainless-steel-blades-dissecting-knife-handles-8/089165b
Glass Pasteur pipettes 230 mm Kimble RK-25554-14 https://www.coleparmer.ca/i/dwk-life-sciences-kimble-disposable-pasteur-pipettes-plugged-end-borosilicate-glass-230-mm-1000-cs/2555414
Ink Sheaffer 94321 https://www.amazon.com/Sheaffer-Skrip-Bottled-Black-94231/dp/B002IKKKUU
Melting guide: modified paint Scraper, 2-in Mastercraft #049-7335-8 https://www.canadiantire.ca/en/pdp/mastercraft-carbon-steel-flexible-spackling-putty-knife-wall-paint-scraper-2-in-0497335p.0497335.html?loc=plp
Microscopy glass slide Fisher Scientific 12-552-5 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/125525
Nitex nylon mesh filter screen  Dynamic Aqua-Supply Ltd. NTX30-108 https://dynamicaquasupply.com/products/nitex-screen?_pos=1&_sid=ffc105328&_ss=r&
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Paper clip Makanu ‎Clips-BK-41mm-24 https://www.amazon.ca/classeur-standard-grandes-trombones-excellentes
Parafilm Avantor/vwr 470201-930 https://www.avantorsciences.com/ca/en/product/8882964/parafilm
Plantago lanceolata seeds ecoumene NA https://www.ecoumene.com/produit/semences/herbacees/plantain-lanceole-bio/
Polyvinyl alcohol-lactic acid-glycerol (PVLG). NA NA https://invam.ku.edu/recipes
Pyrography kit with fine tip Walnut Hollow 483103 https://www.walnuthollow.com/collections/creative-wood-burning/products/walnut-hollow-creative-versa-tool
Silicone sealant Aqueon 100165003 https://www.aqueon.com/products/aquariums/silicone-sealant
Surgeon scalpel handle Fisher Scientific 22-079657 https://www.fishersci.ca/shop/products/surgical-design-scalpel-handles-blades/22079657#?keyword=scalpel
Two Speed Rotary Tool Kit Dremel 200-1/21 https://www.dremel.com/ca/en/p/200-1-21-f0130200ah
Vermiculite PRO-MIX 4981110 https://www.canadiantire.ca/fr/pdp/vermiculite-pro-mix-9-l-0597936p.0597936.html
X1000 Round Coverslip dia. 30 mm #1 (0.13–0.16 mm) Fisher Scientific 12164692 https://www.fishersci.fi/shop/products/x1000-cover-slip-diam-30-mm-n-1-1/12164692
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Referencias

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Paré, L., Banchini, C., Stefani, F. Inoculating and Observing Arbuscular Mycorrhizal Cultures on Superabsorbent Polymer-Based Autotrophic Systems. J. Vis. Exp. (208), e66848, doi:10.3791/66848 (2024).
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