La evaluación de las diferencias anatómicas entre las secciones transversales de las hojas C3 y C4 ayuda a comprender la eficiencia de la fotosíntesis. Este artículo describe la preparación y el examen de las secciones transversales de hojas semifinas y a mano alzada, junto con las advertencias en la preparación de las especies de cultivo Triticum aestivum y Zea mays.
La mayor eficiencia de la fotosíntesis deC4 , en comparación con el mecanismo deC3 , surge de su capacidad para concentrar CO2 en las células de la vaina del haz. La eficacia de la fotosíntesisC4 y la eficiencia intrínseca del uso del agua están directamente relacionadas con la proporción de células del mesófilo y de las hojas del haz, el tamaño y la densidad de las vainas del haz, y el tamaño, la densidad y el grosor de la pared celular de las células de la vaina del haz. El análisis microscópico rápido de estos rasgos se puede realizar en secciones a mano alzada y semidelgadas utilizando microscopía óptica convencional, proporcionando información valiosa sobre la eficiencia fotosintética en cultivos deC4 mediante la identificación y el examen de tipos celulares específicos. Además, se muestran los errores en la preparación de secciones a mano alzada y semifinas que afectan a las mediciones anatómicas y a los diagnósticos de tipos de células, así como la forma de evitar estos errores. Este enfoque microscópico ofrece un medio eficiente para recopilar información sobre la aclimatación fotosintética a la variación ambiental y ayuda en la detección rápida de cultivos para climas futuros.
La fotosíntesis es un proceso fundamental en el que la energía luminosa se convierte en energía química, sirviendo como piedra angular de las redes tróficas terrestres. La mayoría de las plantas siguen la vía C3 de la fotosíntesis, donde el principal producto fotosintético es el compuesto de tres carbonos glicerato 3-fosfato. La fotosíntesis deC3 evolucionó hace más de 2.000 millones de años en una atmósfera abundante enCO2 y baja enO21. La enzima fotosintética clave, la ribulosa 1,5 bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (Rubisco), que evolucionó en estas condiciones, no es óptima para las condiciones actuales de bajo contenido deCO2 y alto contenido deO2, ya que reacciona competitivamente con elO2, iniciando la fotorrespiración2. La fotorrespiración es una vía de despilfarro que consume energía en lugar de producirla y liberarCO2 como subproducto. En consecuencia, es crucial mantener una alta concentración deCO2 alrededor de Rubisco en los cloroplastos para prevenir la oxigenación 3,4. Debido a la incapacidad de las plantasC3 para concentrar el CO2, se produce una importante reducción de CO2 del aire ambiente a los cloroplastos, lo que frena la fotosíntesis y afecta al crecimiento de las plantas y a la producción de biomasa 2,5,6.
En las plantasC3, la fotosíntesis está limitada por la entrada de CO2 a través de los estomas, su difusión a través del mesófilo y la actividad bioquímica de las enzimas fotosintéticas. La entrada de CO2 está limitada primero por la conductancia estomática, que está controlada por condiciones ambientales como la temperatura y la humedad del aire. Luego, el CO2 se difunde a través de la fase gaseosa y líquida interna de la hoja a Rubisco7. En las plantasC3, todas las etapas de la fotosíntesis ocurren en los cloroplastos de las células mesófilas, y las plantas necesitan mantener una afluencia constante de CO2 de la atmósfera a los cloroplastos. La dependencia de la disponibilidad deCO2 en los cloroplastos de la apertura estomática, la arquitectura mesófila y las características individuales de las células y los cloroplastos hace que las plantas sean susceptibles a las limitaciones ambientales que eventualmente afectan la fotosíntesis, como la baja disponibilidad de agua y las altas temperaturas 7,8,9,10, destacando particularmente su vulnerabilidad a las condiciones del cambio climático11.
Dados los desafíos planteados por las ineficiencias de la víaC3, así como las limitaciones para mantener niveles óptimos de CO2 y susceptibilidad a factores ambientales, en ciertas plantas, ha evolucionado otra vía, la vía de fotosíntesisC4. Característicamente, las plantasC4 tienen dos vías bioquímicas separadas espacialmente; la fijación inicial de CO2 se produce en las células del mesófilo por la fosfoenolpiruvato carboxilasa, que tiene una mayor afinidad por el CO2 que Rubisco y también carece de actividad de oxigenación. El productoC4 formado se transporta posteriormente a las células de la vaina del haz, donde se descarboxila, y el CO2 es nuevamente liberado y fijado por Rubisco (fotosíntesis de C3)12,13,14. La mayor afinidad de la PEP carboxilasa al CO2 y a las paredes celulares gruesas de las células de la vaina del haz permite la concentración de CO2 en las células de la vaina del haz y, por lo tanto, las plantas deC4 minimizan la fotorrespiración al segregar espacialmente la fijación de CO2 y el ciclo de Calvin. La adopción de la vía C4 muestra la respuesta adaptativa de la naturaleza a las limitaciones ambientales, ofreciendo información sobre posibles estrategias para mejorar la productividad y la resiliencia de los cultivos en condiciones climáticas cambiantes15.
La anatomía especializada de la estructura de la hoja en las plantasC4 se caracteriza por venas rodeadas de células de la vaina del haz vascular agrandadas que contienen cloroplastos y con una disposición radial de las células del mesófilo en un patrón de anillo exterior alrededor de las células de la vaina del haz. Las células mesófilas están muy cerca de las células de la vaina del haz, lo que permite un transporte rápido y continuo de metabolitos entre los dos tipos de células. La disposición de esta célula es típica de las plantas C4 y se conoce como anatomía de Kranz16. En las especiesC3, la especialización y disposición de las células mesófilas pueden variar, pero las células de la vaina del haz son claramente más pequeñas y tienen unos pocos cloroplastos o ningún cloroplasto. La anatomía específica de Kranz permite concentrar el CO2 en los cloroplastos de las células de la vaina donde se encuentra la enzima carboxilanteC3 Rubisco, dificultando eficazmente la fotorrespiración 4,17,18. A pesar de su disposición aparentemente compleja, estos cambios han ocurrido de forma independiente múltiples veces en la evolución de las angiospermas, lo que indica que es una vía evolutiva relativamente factible 19,20,21, y se ha demostrado que varios taxones se encuentran en una etapa intermedia entre el metabolismo del carbono C3 y C 4, denominados C3-C 4 o C2, tener habilidades para concentrarse y reasimilar CO2 22,23,24,25.
Muchas plantasC4 son cultivos de gran importancia económica, y la ingeniería genética de cultivosC3, como el arroz, para mejorar su resiliencia climática y asegurar el rendimiento ha sido un tema de interés en las últimas décadas26,27. Sin embargo, los esfuerzos de ingeniería requieren una comprensión detallada de la anatomía especializada deC4 y cómo controla la fotosíntesis 2,28.
El establecimiento de la anatomía de C4 Kranz es un requisito previo para lograr el ambicioso objetivo de diseñar la fotosíntesis de C4 en cultivos de C3 25. Sin embargo, la comprensión actual de la regulación de la anatomía del Kranz y los métodos para detectar rápidamente sus rasgos anatómicos clave es limitada, lo que dificulta la identificación de especies híbridas. Estudios previos han demostrado que los rasgos clave que regulan la eficiencia fotosintética en las plantas C3 y C4 incluyen la distancia intervenal, el diámetro del complejo de la vaina del haz y el tamaño de las células de la vainadel haz 14,29. Estos rasgos pueden filtrarse fácilmente utilizando secciones a mano alzada y analizarse cuantitativamente utilizando secciones semifinas. Aquí, describimos el método de evaluación de los rasgos que permiten el diagnóstico de la diferenciación anatómica de C3 y C4 a través de microscopía cruzada y óptica a mano alzada, a saber, el área de la vaina del haz, la distancia intervenal y la frecuencia de las venas.
En este artículo, discutimos los métodos cuantitativos y cualitativos para medir la anatomía de las hojas y las formas en que se pueden optimizar. Además, la metodología se aplica a especies representativas de cultivos con el fin de determinar qué rasgos anatómicos son más útiles para distinguir entre las secciones transversales C3 y C4 . La comprensión de estos rasgos es esencial, ya que las especies híbridas, denominadas fotosíntesisC2 , se están convirtiendo en una vía de…
The authors have nothing to disclose.
Los autores reconocen el Programa H2020 de la Unión Europea (proyecto GAIN4CROPS, GA nº 862087). El Centro de Excelencia AgroCropCropFuturo Agroecología y nuevos cultivos en climas futuros está financiado por el Ministerio de Educación e Investigación de Estonia. Deseamos agradecer a la profesora Evelin Loit-Harro por proporcionar semillas de T. aestivum y Z. mays, a Paula Palmet y Vaiko Vainola por su asistencia en la preparación de las secciones transversales de las hojas, y a João Paulo de Silva Souza por su asistencia con el análisis. Todas las imágenes se obtuvieron de la unidad de microscopía de la Universidad de Ciencias de la Vida de Estonia en el marco de varios proyectos.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO42H2O) pure | PENTA, CZ | 10028-24-7 | |
Embedding Film, 7.8 mil Thick, 8 x 12.5, (203 x 318mm) | ACLAR, US | 10501-10 | |
Ethanol, abs. 100% a.r. | Chem-Lab NV, BE | CL00.0505.1000 | Danger: Highly inflammable liquid and vapour. |
EVOS Invitrogen FL Auto 2 Imaging System | Thermo Fisher Scientific, US | ||
Flat Embedding PTFE Mold with Metal Frame, 16 cavities | PELCO, US | 10501 | |
Glass vial 2 ml | VWR Life Science, US | 548-0045 | |
Glutaraldehyde 50% solution | VWR Life Science, US | 23H2856331 | Danger: Fatal if inhaled. Toxic if swallowed. Causes severe skin burns and eye damage. May cause respiratory irritation. Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection. |
Histo diamond knife | Diatome, US | ||
LEICA EM UC7 | Leica Vienna, AT | ||
LR White resin hard grade | Electron Microscopy Sciences, US | 14383 | Danger: Causes skin irritation. Causes severe eye irritation May cause respiratory irritation. May cause drowsiness or dizziness Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection. |
Microscope slides | Normax, PT | 5470308A | |
Nikon Eclipse E600 and Nikon DS0Fi1 5 MP | Nikon Corporation, JP | ||
Osmium Tetroxide (OsO4) | Agar Scientific Ltd, GB | R1019 | Danger: Fatal if swallowed, in contact with skin or if inhaled. Causes severe skin burns and eye damage Wear double protective gloves, protective clothing, eyes and face protection. |
Pipette and pipette tips | Thermo Scientific, FI | KJ16047 | |
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 . 2H2O) pure | PENTA, CZ | 13472-35-0 | |
Syringe 10 ml | Ecoject, DE | 20010 | |
Toluidine blue, general purpose grade | Fisher Scientific, GB | 2045836 |