Este protocolo presenta una línea completa para analizar muestras obtenidas de corazones humanos que abarcan las escalas microscópica y macroscópica.
El estudio detallado de los corazones humanos no defectuosos rechazados para trasplante ofrece una oportunidad única para realizar análisis estructurales a escala microscópica y macroscópica. Estas técnicas incluyen la limpieza de tejidos (imágenes tridimensionales (3D) habilitadas para inmunomarcaje modificado de órganos aclarados con solvente) y tinción inmunohistoquímica. Los procedimientos de examen mesoscópico incluyen la disección estereoscópica y la tomografía microcomputarizada (TC). Los procedimientos de examen macroscópico incluyen la disección macroscópica, la fotografía (incluidos los anaglifos y la fotogrametría), la tomografía computarizada y la impresión 3D del corazón o del corazón entero, disecado física o virtualmente. Antes del examen macroscópico, se puede realizar una fijación de presión-perfusión para mantener la arquitectura 3D y la morfología fisiológicamente relevante del corazón. La aplicación de estas técnicas en combinación para estudiar el corazón humano es única y crucial para comprender la relación entre las distintas características anatómicas, como la vasculatura coronaria y la inervación miocárdica, en el contexto de la arquitectura 3D del corazón. Este protocolo describe las metodologías en detalle e incluye resultados representativos para ilustrar el progreso en la investigación de la anatomía cardíaca humana.
Dado que la función sigue a la forma, la comprensión de la arquitectura del corazón es fundamental para apreciar su fisiología. A pesar de que numerosas investigaciones han revelado la anatomía cardíaca desde la micro hasta la macroescala 1,2,3, múltiples preguntas siguen sin resolverse, especialmente las relacionadas con la anatomía cardíaca humana. Esto se debe, en parte, a que los estudios básicos centrados en la anatomía funcional generalmente utilizaban corazones de animales 4,5,6, que a menudo son distintos de los corazones humanos 1,7,8. Además, cada estudio individual, incluso aquellos que utilizan muestras de corazón humano, tiende a centrarse en estructuras muy específicas, lo que dificulta la aplicación de los hallazgos en el contexto de todo el corazón. Esto es aún más cierto si las estructuras enfocadas están en micro o mesoescala, como el perinexus9 y los plexos ganglionares10.
En este contexto, el estudio estructural sistémico del corazón humano rechazado para trasplante ofrece una oportunidad única y poco común para obtener un atlas completo de las estructuras cardíacas en foco a escalas microscópicas y macroscópicas11. Los protocolos de examen microscópico incluyen la limpieza de tejidos (imágenes tridimensionales (3D) habilitadas para inmunomarcaje modificado de órganos aclarados con solvente, iDISCO+)12,13 y tinción inmunohistoquímica. Los protocolos de examen mesoscópico incluyen disección estereoscópica, macrofotografía y tomografía microcomputarizada (TC). Los protocolos de examen macroscópico incluyen disección macroscópica14, fotografía (incluyendo anaglifos y fotogrametría)15,16,17, TC, disección virtual 18 e impresión 3D del corazón físico o virtualmente disecadoo completo 17. En preparación para el examen macroscópico, se realiza la fijación presión-perfusión para mantener la arquitectura 3D y la morfología fisiológicamente relevante del corazón 14,19,20,21. La aplicación combinada de estas técnicas es única y crucial para correlacionar distintas características anatómicas en el contexto de la arquitectura 3D del corazón humano.
Dado que la oportunidad de obtener una muestra de corazón humano no patológico es extremadamente limitada, el enfoque multiescala descrito en este documento maximiza el uso de la muestra. Mediante la aplicación de varios procedimientos que se describen a continuación, los resultados representativos ilustrarán al lector cómo los hallazgos se pueden utilizar para múltiples propósitos, incluido el descubrimiento en la investigación científica11 (análisis exhaustivos de la inervación cardíaca, distribución de los plexos ganglionares), la mejora de los procedimientos clínicos (simulación para enfoques quirúrgicos e intervencionistas) y la educación anatómica (demostración real en 3D de la anatomía cardíaca).
El presente estudio demuestra el proceso exhaustivo para analizar muestras obtenidas de corazones humanos completos. Los resultados representativos muestran exámenes anatómicos a micro y macroescala realizados de forma rutinaria para un solo corazón. Dado que una muestra de corazón humano es extremadamente valiosa, un enfoque multiescala es ideal y eficaz para no desperdiciar ninguna parte de la muestra mediante la aplicación de múltiples protocolos para diversos fines, incluido el descubrimiento en la investigaci?…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a las personas que han donado sus cuerpos para el avance de la educación y la investigación. Estamos agradecidos a la Fundación OneLegacy, que formó la base para obtener corazones de donantes para la investigación. También agradecemos a Anthony A. Smithson y Arvin Roque-Verdeflor del Centro de Investigación Traslacional de Imágenes (Departamento de Radiología) de UCLA por su apoyo en la adquisición de datos de TC. Este proyecto fue apoyado por el Proyecto Amara Yad de UCLA. Agradecemos a los doctores Kalyanam Shivkumar y Olujimi A. Ajijola por establecer y mantener una línea de investigación sobre el corazón humano. Agradecemos a nuestra Gerente de Operaciones de Investigación, Amiksha S. Gandhi, por su dedicación para apoyar nuestros proyectos. Este trabajo fue posible gracias al apoyo de las subvenciones de los NIH OT2OD023848 y P01 HL164311 y la subvención Leducq 23CVD04 a Kalyanam Shivkumar, el Premio de Desarrollo Profesional de la Asociación Americana del Corazón 23CDA1039446 a PH y el Proyecto Amara-Yad de UCLA (https://www.uclahealth.org/medical-services/heart/arrhythmia/about-us/amara-yad-project). El escáner microPET/CT GNEXT utilizado en este estudio fue financiado por una subvención de Instrumentación Compartida para Investigación Animal de los NIH (1 S10 OD026917-01A1).
1x Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
3D Viewer | Microsoft | ||
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-605-152 | |
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 713-605-147 | |
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lens | Nikon | ||
Anti-Actin, α-Smooth Muscle – Cy3 antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0) | Abcam | ab93680 | |
Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5) | Abcam | ab108986 | |
Anti-TH (tyrosine hydrox ylase) | Abcam | ab1542 | |
Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter) | Synaptic Systems | 139 103 | |
Benzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-10G | |
Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mm | NinjaTek | ||
Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5 | VWR | 48393 151 | |
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-165-152 | |
Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997-100ML | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-500ML | |
Ethanol, 100% | Decon laboratories | 2701 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-500G | |
GNEXT PET/CT | SOFIE Biosciences | ||
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
Histodenz | Sigma-Aldrich | D2158-100G | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009-500ML | |
Imaging software | Zeiss | ZEN (black edition) | |
Imaging software | Oxford Instruments | Imaris 10 | |
iSpacer | Sunjin Labs | iSpacer 3mm | |
KIRI Engine | KIRI Innovation | ||
Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 880 | |
LEAD-2 – Vertical & Multi-channels Peristaltic Pump | LONGER | ||
Lightview XL | Brightech | ||
Methanol (Certified ACS) | Fischer Scientific | A412-4 | |
Nikon D850 | Nikon | ||
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4 | NinjaTek | ||
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-121 | |
Original Prusa MK4 3D printer | Prusa Research | ||
PAP pen | Abcam | ab2601 | |
Paraformaldehyde, 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
Polycam | Polycam | ||
Primary antibody | |||
PrusaSlicer 2.7.1 | Prusa Research | ||
SARA-Engine | pita4 mobile LLC | ||
Scaniverse | Niantic | ||
Secondary antibody | |||
SlowFade Gold Antiface Mountant | Invitrogen | S36936 | |
Sodium azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical Company | 7144.8-32 | |
SOMATOM Definition AS | Siemens Healthcare | ||
Standard Field Surgi-Spec Telescopes, | Designs for Vision | ||
Stereomicroscope System SZ61 | OLYMPUS | ||
StereoPhoto Maker | Free ware developed by Masuji Suto | ||
Superfrost Plus Microscope Slides, Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ML | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L | |
Ziostation2 | Ziosoft, AMIN |