Este protocolo describe el procedimiento para disociar rápidamente muestras de tumores humanos y de ratón para la secuenciación de ARN de una sola célula.
Las muestras de tumores humanos contienen una gran cantidad de información sobre su microambiente y su repertorio inmunitario. La disociación efectiva de muestras de tejido humano en suspensiones celulares viables es un insumo necesario para la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNAseq). A diferencia de los enfoques de secuenciación masiva de ARN, scRNAseq nos permite inferir la heterogeneidad transcripcional en muestras tumorales a nivel de una sola célula. La incorporación de este enfoque en los últimos años ha dado lugar a muchos descubrimientos, como la identificación de estados y programas celulares inmunitarios y tumorales asociados a las respuestas clínicas a las inmunoterapias y otros tipos de tratamientos. Además, las tecnologías unicelulares aplicadas a tejidos disociados se pueden utilizar para identificar el repertorio de receptores de células T y B de las regiones de cromatina accesibles, y la expresión de proteínas, utilizando anticuerpos con código de barras de ADN (CITEseq).
La viabilidad y la calidad de la muestra disociada son variables críticas cuando se utilizan estas tecnologías, ya que pueden afectar drásticamente a la contaminación cruzada de células individuales con ARN ambiental, a la calidad de los datos y a la interpretación. Además, los protocolos de disociación largos pueden conducir a la eliminación de poblaciones celulares sensibles y a la regulación positiva de una firma génica de respuesta al estrés. Para superar estas limitaciones, ideamos un protocolo de disociación universal rápida, que ha sido validado en múltiples tipos de tumores humanos y murinos. El proceso comienza con la disociación mecánica y enzimática, seguida de la filtración, la lisis de sangre roja y el enriquecimiento de muertos vivos, adecuado para muestras con un bajo aporte de células (por ejemplo, biopsias con aguja). Este protocolo garantiza una suspensión unicelular limpia y viable, primordial para el éxito de la generación de emulsiones de gel (GEM), códigos de barras y secuenciación.
Aunque muchos avances en la investigación del cáncer han llevado al desarrollo y la aprobación de la FDA de agentes dirigidos a los receptores inhibidores expresados en las células inmunitarias y tumorales, conocidos como inhibidores del bloqueo de puntos de control, la resistencia a la terapia y la identificación de los mecanismos que impulsan la respuesta del paciente siguensiendo un desafío. El complejo desafío de caracterizar la heterogeneidad tumoral en su diversidad molecular y la intrincada interacción entre las células tumorales y el microambiente inmunitario requiere nuevos enfoques para diseccionar este complejo ecosistema con una resolución de una sola célula. Comprender las complejidades moleculares dentro de los tumores y sus microentornos es fundamental para avanzar en estrategias terapéuticas y descifrar la compleja biología subyacente ala progresión del cáncer. La secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) se ha vuelto cada vez más popular porque proporciona análisis de alta resolución de células individuales dentro de muestras tumorales complejas 3,4.
La heterogeneidad tumoral, que abarca diversidades genéticas, epigenéticas y fenotípicas, plantea un desafío para descubrir las complejidades de la biología del cáncer5. Los métodos convencionales de secuenciación masiva de ARN tienden a oscurecer los perfiles de expresión únicos y los fenotipos de las poblaciones celulares heterogéneas presentes dentro de los tumores, ya que estos métodos promedian las señales en poblaciones celulares enteras4. Por el contrario, scRNA-seq permite la disección de tipos de células individuales, revelando diversas expresiones génicas, patrones de represión y estados celulares que de otro modo se pasarían por alto 4,6. La premisa de scRNA-seq radica en su capacidad para decodificar las firmas genéticas y moleculares de las células individuales, lo que es muy prometedor para descubrir nuevasterapias contra el cáncer.
Al descifrar los perfiles de expresión génica de las células tumorales y las células estromales e inmunitarias circundantes, los investigadores pueden identificar nuevos objetivos terapéuticos y desarrollar estrategias de medicina genética de precisión adaptadasa pacientes individuales. Además, la disección del repertorio inmunitario dentro del microambiente tumoral proporciona información crucial sobre la interacción entre las células tumorales y los efectores inmunitarios, allanando el camino para las intervenciones inmunoterapéuticas3. A pesar de los avances en el uso de scRNAseq en muestras clínicas, varios desafíos durante los pasos de procesamiento pueden dañar la integridad del ARN de la célula, la viabilidad y la calidad de los datos generados. Además, el procesamiento de tejidos con baja viabilidad celular puede aumentar los niveles de ARN ambiental en las gotas generadas durante la encapsulación de células individuales, lo que da lugar a una contaminación cruzada y a una anotación incorrecta de los tipos de células, mientras que los largos protocolos de disociación realizados a 37 °C pueden conducir a la regulación positiva de una firma génica de respuesta al estrés en múltiples tipos de células 8,9, 10.
El procedimiento escalonado (Figura 1A) descrito en este protocolo comienza con una rápida disociación mecánica y enzimática de los tumores, seguida de la filtración y la eliminación de las células muertas, dependiendo de la viabilidad de cada muestra tumoral. En la actualidad, este procedimiento ha sido verificado en muestras de tumores de melanoma11, colorrectal12, carcinoma escamoso de cabeza y cuello13, páncreas y pulmón (datos no publicados). Estas técnicas garantizan la generación de suspensiones de células viables de alta calidad, cruciales para los análisis posteriores14. En particular, la eliminación de glóbulos rojos, desprovistos de ARN sintetizado, se vuelve imperativa para purificar la muestra15. La evaluación posterior de los recuentos celulares y la eliminación de las células muertas sirven como requisito previo para el éxito de la generación exitosa de emulsión de gel de gel (GEM), el código de barras y el aumento de la recuperación de transcripciones y células secuenciadas sin poner en peligro la exclusión de poblaciones sensibles (por ejemplo, neutrófilos y células epiteliales)16. Estos pasos son fundamentales para liberar el potencial del análisis de resolución de una sola célula dentro de muestras tumorales 9,10, descubrir nuevos perfiles de expresión génica y firmas inmunitarias necesarias para impulsar intervenciones terapéuticas innovadoras e identificar nuevas vulnerabilidades tumorales.
Este protocolo describe la disociación de muestras de tumores humanos o murinos en una suspensión unicelular para la secuenciación de ARNc utilizando el sistema microfluídico 10x Genomics. En el procesamiento de tejidos que a menudo provienen de cánceres raros o que forman parte de ensayos clínicos en curso o experimentos largos para tumores murinos, la muestra debe conservarse de manera óptima y cuidadosa entre todos los pasos. Todos los pasos deben llevarse a cabo rápidamente en hielo o a 4 °C para mantener lo…
The authors have nothing to disclose.
Este estudio contó con el apoyo de la Fundación de Investigación Médica Adelson (AMRF), la Alianza para la Investigación del Melanoma (MRA) y U54CA224068. Las figuras 1, 4 y 5 se crearon con BioRender.com.
1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
10 mL serological pipette | Corning | 357551 | |
1000 μL low-retention pipette tips | Rainin | 30389213 | |
1000 μL low-retention wide pipette tips | Rainin | 30389218 | |
1000 μL pipette tips | Rainin | 30389212 | |
10x Magnetic Separator | 10x Genomics | 120250 | |
15 mL conical tubes | Corning | 430052 | |
2 mL aspirating pipette | Corning | 357558 | |
20 μL low-retention pipette tips | Rainin | 30389226 | |
20 μL pipette tips | Rainin | 30389225 | |
200 μL low-retention pipette tips | Rainin | 30389240 | |
200 μL pipette tips | Rainin | 30389239 | |
50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
60 x 15 mm Tissue Culture Dish | Falcon | 353004 | |
ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-1 | |
BD 1 mL syringe | Becton, Dickinson and Company | 3090659 | |
Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 551660 | |
Calcium Chloride Solution | Sigma Aldrich | 2115-100ML | |
Cell Ranger | 10x Genomics | N/A | https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest |
Cell counting slides for TC20 cell counter | Bio-Rad | 1450015 | |
CellTrics 30μm sterile disposable filters | Sysmex | 04-004-2326 | |
CellTrics 50μm sterile disposable filters | Sysmex | 04-004-2327 | |
Dead Cell removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | Store at -20 °C; kit 2 |
Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
DNA LoBind Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
EasySepTM Dead Cell Removal (Annexin V) Kit |
STEMCELL Technologies | 17899 | Store at 4 °C; Kit 1 |
Eppendorf centrifuge 5425R | Eppendorf | 5406000640 | |
Eppendorf centrifuge 5910R | Eppendorf | 2231000657 | |
Eppendorf Easypet 3 Electronic Pipette controller | Eppendorf | EP4430000018 | |
Eppendorf Thermomixer F1.5 Model 5384 | Eppendorf | EP5384000012 | |
FBS | Gibco | 26140-079 | Store at 4 °C, use in a Biological hood |
German Stainless Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
Leica Dmi1 Microscope | Leica Microsystems | 454793 | |
LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Rainin | 17014382 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Rainin | 17014391 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Rainin | 17014392 | |
Quadro MACS Magnet | Miltenyi Biotec | 130-091-051 | |
RPMI Medium 1640 (1x) | Gibco | 21870-076 | Store at 4 °C |
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube strips | USA Scientific | 1402-4700 | |
Trypan blue stain 0.4% | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
Tumor Dissociation Kit, Human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme H vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit. |
Tumor Dissociation Kit, Mouse | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme D vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit. |
UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Store at 4 °C |