Aquí, detallamos un protocolo simple, rápido y confiable de citometría de flujo multiparamétrica y asistida por tumores en un chip para monitorear y caracterizar los pasos que constituyen el ciclo de inmunidad al cáncer. De hecho, una comprensión profunda de las interacciones entre el cáncer y las células inmunitarias proporciona información crítica para burlar a los tumores y guiar la atención clínica.
La investigación fundamental sobre el cáncer y el desarrollo de terapias eficaces para contrarrestar el ataque se basan en estudios experimentales que detallan las interacciones entre el cáncer y las células inmunitarias, el llamado ciclo cáncer-inmunidad. Los sistemas de cocultivo in vitro combinados con citometría de flujo multiparamétrica (mFC) y dispositivos microfluídicos de tumor en chip (ToC) permiten una monitorización y caracterización sencillas, rápidas y fiables de cada paso del ciclo de inmunidad al cáncer y conducen a la identificación de los mecanismos responsables de inclinar la balanza entre la inmunovigilancia del cáncer y la inmunoevasión. Una comprensión profunda de las interacciones dinámicas entre el cáncer y las células inmunitarias proporciona información crítica para burlar a los tumores y acelerará el ritmo de la personalización y optimización terapéutica en los pacientes. En concreto, detallamos un protocolo sencillo asistido por mFC y ToC para desentrañar las complejidades dinámicas de cada paso del ciclo de inmunidad al cáncer en líneas celulares de cáncer murino y células inmunitarias derivadas de ratones, y nos centramos en la inmunovigilancia. Teniendo en cuenta las características relacionadas con el tiempo y el costo de este protocolo, sin duda es factible a gran escala. Además, con pequeñas variaciones, este protocolo puede adaptarse tanto a líneas celulares de cáncer humano como a células inmunitarias derivadas de sangre periférica humana y combinarse con la inhibición genética y/o farmacológica de vías específicas para identificar biomarcadores de respuesta inmunitaria.
En las últimas décadas, la inmunoterapia ha estado a la vanguardia de las opciones de vanguardia para el tratamiento del cáncer. El aprovechamiento del sistema inmunitario con fines antitumorales ha proporcionado una poderosa prueba de concepto para el beneficio del paciente en diversas neoplasias malignas hematológicas y sólidas con pronósticos históricamente malos. A medida que la inmunoterapia ofrece una oportunidad para cánceres que de otro modo serían difíciles de tratar, está experimentando un progreso asombrosamente rápido. Este progreso puede atribuirse, al menos en parte, a la comprensión refinada de la interacción entre las células cancerosas y las células inmunitarias. Esta interacción se asemeja a un “motor” de retroalimentación que el sistema inmunitario enciende para destruir las células cancerosas, el llamado ciclo de inmunidad al cáncer. Esta respuesta inmunitaria contra el cáncer progresa a través de tres niveles principales: reconocimiento, procesamiento y reacción. En primer lugar, en la fase de reconocimiento, las células cancerosas moribundas en el microambiente tumoral liberan antígenos tumorales (Ags) producidos durante la formación del tumor (TME, paso 1) y son engullidos por las células dendríticas infiltrantes del tumor (CD, paso 2). A continuación, en la fase de procesamiento, las CD presentan los epítopos de los Ags tumorales capturados a través de las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), expresan en su superficie niveles más altos de moléculas coestimuladoras (paso 3) y se trasladan a los ganglios linfáticos drenadores del tumor (dLN) para presentar su carga a las células T CD8 vírgenes (CD8N, paso 4). Todos estos pasos convergen en el proceso final de reacción durante el cual se activan las células T CD8 (CD8C-P) específicas de Ag tumoral, maduran en células T CD8 efectoras (CD8E) y experimentan una expansión clonal (paso 5). Luego, las célulasE CD8 abandonan las dLN y regresan a casa a través de la sangre hasta el TME (paso 6), donde reconocen específicamente y se unen a las células cancerosas a través de la interacción entre su receptor de células T (TCR) y sus Ags tumorales afines, liberan moléculas citotóxicas [es decir, interferón (IFN)-γ, perforinas y granzimas (Grzs)] y matan las células cancerosas (paso 7)1, 2. La destrucción de las células cancerosas conduce a la liberación de más Ags tumorales para alimentar el ciclo de inmunidad contra el cáncer. De hecho, a través de todos estos pasos, el sistema inmunológico destruye y rechaza las células cancerosas con mucha más frecuencia de lo que se supone. Sin embargo, en los pacientes con cáncer, al menos uno de estos pasos no funciona correctamente. Nosotros y otros demostramos que las células cancerosas buscan detener la respuesta inmune evolucionando hacia variantes más agresivas y con privilegios inmunológicos 3,4,5 o dificultando la efectividad de las células T 6,7.
Tanto la investigación como el desarrollo de fármacos oncológicos se basan en modelos experimentales que permiten estudiar la relación entre el cáncer y las células inmunitarias, la llamada oncoinmunología. A continuación se describen modelos in vitro rápidos, fiables, reproducibles y de bajo coste que reproducen de forma exhaustiva cada paso del ciclo onco-inmunológico y ofrecen una visión rápida y clara de los conjuntos de características fenotípicas y funcionales de la inmunovigilancia y, finalmente, de la inmunoedición.
La citometría de flujo multiparamétrica (mFC) es una de las herramientas analíticas unicelulares más exitosas en la investigación fundamental, el diagnóstico y la investigación traslacional del cáncer en ensayos clínicos del cáncer. Dado que permite capturar simultáneamente más características en cada célula, mFC se ha ganado su lugar como una plataforma de análisis de referencia en oncoinmunología. Combina una alta sensibilidad y especificidad con la posibilidad de medir múltiples patrones de expresión de proteínas y propiedades funcionales de forma rápida y reproducible a nivel de una sola célula a partir de suspensiones celulares heterogéneas e incluso heterotípicas, como las del TME 8,9,10. Dado que tanto los patrones de expresión fenotípicos como los funcionales son sensibles al tiempo, la atención cuidadosa al diseño del experimento, la selección de paneles, controles y anticuerpos titulados adecuados, así como el procesamiento de la muestra y el uso adecuado de la instrumentación son fundamentales para la fiabilidad, comparabilidad y reproducibilidad de los resultados y para interpretar con confianza el resultado del experimento11.
Los dispositivos microfluídicos (ToC) de tumores en un chip modelan el TME al permitir la biomimética a microescala in vitro de la dinámica e interacciones entre el cáncer y las células inmunitarias 12,13,14,15. En concreto, los ToCs son dispositivos de cultivo celular microfluídicos multicanal capaces de albergar diversos tipos de células organizadas en entornos de cultivo bidimensionales (2D) o tridimensionales (3D) y capaces de modelar con alta fidelidad y controlar con alta precisión, unidades estructurales y funcionales clave, como las interacciones celulares heterotípicas y los flujos de gradientes químicos que ocurren fisiológicamente en el TME12, 13,14,15. En particular, la quimioatracción y las trayectorias inmunitarias, así como la interacción de las células inmunitarias con las células cancerosas, pueden monitorizarse en tiempo real y cuantificarse mediante microscopía de lapso de tiempo y análisis de seguimiento automatizado 5,12,13,14,15,16. Además, las TdC ofrecen la posibilidad de analizar y manipular procesos cruciales que regulan la aparición y progresión del cáncer y la respuesta a la terapia17.
En este artículo, se combinan mFC con ToCs para estudiar todos los niveles de la respuesta inmune anticancerígena que pasan por la fagocitosis mediada por DC de las Ags cancerosas (pasos 1-3), el cebado cruzado de células T (paso 4), la activación y expansión clonal (esta última mediante la tecnología de cicloadición catalizada por 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) y Cu(I), una metodología altamente sensible y precisa, paso 5), la localización de célulasE CD8 en el TME (paso 6) y, finalmente, la destrucción de células cancerosas mediada por célulasE CD8 (paso 7, Figura 1).
Este trabajo contribuye al esfuerzo por establecer protocolos estándar simples, rápidos y confiables para estudiar el ciclo de inmunidad al cáncer. La mejora e integración de los modelos mFC y ToC en la investigación del cáncer, la dinámica de la EMT y la respuesta a la terapia tienen un gran potencial, ya que estos modelos proporcionan fidelidad biológica junto con el control experimental. Por lo tanto, este protocolo ayuda a recrear, de manera escalonada, el ciclo de inmunidad al cáncer al permitir caracterizar, monitorear y maniobrar oportunamente los roles de los actores celulares individuales y sus interacciones recíprocas sobre la inmunovigilancia natural y adquirida. En última instancia, esto ayudará a refinar, reducir y reemplazar los estudios en animales, al tiempo que proporcionará información crítica para burlar a los tumores y guiar la atención clínica. Por último, las ventajas y limitaciones de mFC y ToC se discuten críticamente y se comparan con las tecnologías de vanguardia (por ejemplo, análisis espaciales de alta complejidad a una sola célula e incluso a resolución subcelular) para impulsar la investigación y el tratamiento oncoinmunológicos.
El seguimiento de la respuesta inmunitaria contra el cáncer es de suma importancia para dilucidar y comprender las intrincadas interacciones moleculares y celulares que actúan en la EMT y respaldan una batalla constante por la supremacía23. A continuación, detallamos un protocolo sencillo asistido por mFC y ToC para el seguimiento y la caracterización de los pasos que constituyen el ciclo cáncer-inmunidad. Con pequeñas variaciones, este protocolo, basado en líneas celulares murinas y célu…
The authors have nothing to disclose.
A.S. está soportado por AIRC (IG #28807) y por PRIN (#P2022YE2MX). M.M. cuenta con el apoyo de la beca AIRC-FIRC (#25558). A.D.N. cuenta con el apoyo del Ecosistema de Innovación Rome Technopole ECS00000024 financiado por la UE – Next Generation EU, PNRR Mission 4 Component 2 Investment 1.5.
1.5 mL microtubes | Eppendorf | 30120086 | |
100 kV e-beam litography | Vistec | ||
100 mm Petri dishes | Greiner Bio One | 664160 | |
12-well plates | Euroclone | ET3012 | |
15 and 50 mL tubes | Corning | 352096; 352070 | |
40 μm cell strainer | Corning | CLS431750 | |
5 mL polystyrene tubes | Greiner Bio-One | 120180 | |
70 μm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
75 cm2 cell culture treated flask | Euroclone | ET7076 | |
Adsorbent wipes | |||
Allumin foil | |||
anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-319 | |
anti-mouse CD25 (7D4) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-118-678 | |
anti-mouse CD3 (17A2) Antibody | BioLegend | 100206 | |
Aptes | Sigma Aldrich | 440140 | |
BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555028 | |
BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A) | BD Biosciences | 555029 | |
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | |
Bovine serum albumin (BSA) | US Biological, Salem | A1312 | |
CD11c Monoclonal Antibody (N418) | eBioscience | 12-0114-81 | |
CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5) | eBioscience | 17-1371-82 | |
CD3 Monoclonal Antibody (17A2) | eBioscience | 25-0032-82 | |
CD44 Monoclonal Antibody (IM7) | eBioscience | 11-0441-82 | |
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | MCD4528 | |
CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3) | eBioscience | 48-0691-82 | |
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 11-0081-82 | |
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 17-0081-82 | |
CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7) | eBioscience | 53-0951-82 | |
Cell counting slides | Kova International | 87144E | |
Chromium quartz masks | MB W&A, Germany | ||
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10635 | |
CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) | EuroClone | ECB4053L | |
EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
Fetal bovine serum (FBS) | EuroClone | ECS0180L | |
Flowjo v10.0.7 | Flowjo, LLC | ||
Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB) | eBioscience | 12-8898-82 | |
H2O2 | Sigma Aldrich | ||
H2SO4 | Sigma Aldrich | ||
hotplate | |||
Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2) | Thermo Scientific | ||
Ice machine | Brema Ice Makers | ||
IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2) | eBioscience | 11-7311-82 | |
Illustrator CC 2015 | Adobe Systems Inc. | ||
ImageJ | National Institute of Health | ||
Incucyte 2022A Software | Sartorius | ||
Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells | Sartorius | 4632 | |
Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System | Sartorius | ||
JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope | Bulldog Bio | ||
Laboratory bench | |||
Laboratory refrigerator (4°C) | |||
Laboratory Safety Cabinet (Class II) | Angelantoni | ||
L-glutamine 200 mM | EuroClone | ECB3004D | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34957 | |
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L10119 | |
MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201; 130-042-401 | |
MACS separators | Miltenyi Biotec | 130-042-10; 130-042-302 | |
MCA205 mouse fibrosarcoma cell line | Sigma-Aldrich | SCC173 | |
Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine | |||
MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002552 | |
Microsoft Excel | Microsoft, Redmond | ||
Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | |
Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-096-543 | |
Nikon ECLIPSE Ts2 | Nikon Instruments Inc. | ||
NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT | Nikon Instruments Inc. | ||
Optical litography | EVG | ||
Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate | EuroClone | ECB3001D/1 | |
Pipet aid | Drummond Scientific Co., Broomall, PA | 4-000-201 | |
Pipettes | Eppendorf | ||
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | PKH67GL-1KT | fluorescent cell linker kit |
plastic coverslip | IBIDI | 10812 | |
Propidium Iodide | Thermo Scientific | P1304MP | |
Reactive Ion Etching system | Oxford plasmalab | ||
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | EuroClone | ECB9006L | |
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO |
CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489 | |
SL 16 Centrifuge Series | Thermo Scientific | 75004031 | |
Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers | |||
Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL) | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 | |
SU-8 3000 series | MicroChem corp, Newton, (MA) | ||
Suite of dermal biopsy punches | Kai Medical, Tedpella | ||
Sylgard 184 | Dowsil, Dow Corning | 101697 | |
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597) | eBioscience | 12-5961-82 | |
Thermostatic bath | |||
Timer | |||
TMCS | Sigma Aldrich | 92360 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Scientific | 15250061 | |
Trypsin-EDTA w/ Phenol Red | EuroClone | ECM0920 | |
Vacuum dessicator |