Summary

Cocultivo de sistemas in vitro para reproducir el ciclo cáncer-inmunidad

Published: June 07, 2024
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Summary

Aquí, detallamos un protocolo simple, rápido y confiable de citometría de flujo multiparamétrica y asistida por tumores en un chip para monitorear y caracterizar los pasos que constituyen el ciclo de inmunidad al cáncer. De hecho, una comprensión profunda de las interacciones entre el cáncer y las células inmunitarias proporciona información crítica para burlar a los tumores y guiar la atención clínica.

Abstract

La investigación fundamental sobre el cáncer y el desarrollo de terapias eficaces para contrarrestar el ataque se basan en estudios experimentales que detallan las interacciones entre el cáncer y las células inmunitarias, el llamado ciclo cáncer-inmunidad. Los sistemas de cocultivo in vitro combinados con citometría de flujo multiparamétrica (mFC) y dispositivos microfluídicos de tumor en chip (ToC) permiten una monitorización y caracterización sencillas, rápidas y fiables de cada paso del ciclo de inmunidad al cáncer y conducen a la identificación de los mecanismos responsables de inclinar la balanza entre la inmunovigilancia del cáncer y la inmunoevasión. Una comprensión profunda de las interacciones dinámicas entre el cáncer y las células inmunitarias proporciona información crítica para burlar a los tumores y acelerará el ritmo de la personalización y optimización terapéutica en los pacientes. En concreto, detallamos un protocolo sencillo asistido por mFC y ToC para desentrañar las complejidades dinámicas de cada paso del ciclo de inmunidad al cáncer en líneas celulares de cáncer murino y células inmunitarias derivadas de ratones, y nos centramos en la inmunovigilancia. Teniendo en cuenta las características relacionadas con el tiempo y el costo de este protocolo, sin duda es factible a gran escala. Además, con pequeñas variaciones, este protocolo puede adaptarse tanto a líneas celulares de cáncer humano como a células inmunitarias derivadas de sangre periférica humana y combinarse con la inhibición genética y/o farmacológica de vías específicas para identificar biomarcadores de respuesta inmunitaria.

Introduction

En las últimas décadas, la inmunoterapia ha estado a la vanguardia de las opciones de vanguardia para el tratamiento del cáncer. El aprovechamiento del sistema inmunitario con fines antitumorales ha proporcionado una poderosa prueba de concepto para el beneficio del paciente en diversas neoplasias malignas hematológicas y sólidas con pronósticos históricamente malos. A medida que la inmunoterapia ofrece una oportunidad para cánceres que de otro modo serían difíciles de tratar, está experimentando un progreso asombrosamente rápido. Este progreso puede atribuirse, al menos en parte, a la comprensión refinada de la interacción entre las células cancerosas y las células inmunitarias. Esta interacción se asemeja a un “motor” de retroalimentación que el sistema inmunitario enciende para destruir las células cancerosas, el llamado ciclo de inmunidad al cáncer. Esta respuesta inmunitaria contra el cáncer progresa a través de tres niveles principales: reconocimiento, procesamiento y reacción. En primer lugar, en la fase de reconocimiento, las células cancerosas moribundas en el microambiente tumoral liberan antígenos tumorales (Ags) producidos durante la formación del tumor (TME, paso 1) y son engullidos por las células dendríticas infiltrantes del tumor (CD, paso 2). A continuación, en la fase de procesamiento, las CD presentan los epítopos de los Ags tumorales capturados a través de las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), expresan en su superficie niveles más altos de moléculas coestimuladoras (paso 3) y se trasladan a los ganglios linfáticos drenadores del tumor (dLN) para presentar su carga a las células T CD8 vírgenes (CD8N, paso 4). Todos estos pasos convergen en el proceso final de reacción durante el cual se activan las células T CD8 (CD8C-P) específicas de Ag tumoral, maduran en células T CD8 efectoras (CD8E) y experimentan una expansión clonal (paso 5). Luego, las célulasE CD8 abandonan las dLN y regresan a casa a través de la sangre hasta el TME (paso 6), donde reconocen específicamente y se unen a las células cancerosas a través de la interacción entre su receptor de células T (TCR) y sus Ags tumorales afines, liberan moléculas citotóxicas [es decir, interferón (IFN)-γ, perforinas y granzimas (Grzs)] y matan las células cancerosas (paso 7)1, 2. La destrucción de las células cancerosas conduce a la liberación de más Ags tumorales para alimentar el ciclo de inmunidad contra el cáncer. De hecho, a través de todos estos pasos, el sistema inmunológico destruye y rechaza las células cancerosas con mucha más frecuencia de lo que se supone. Sin embargo, en los pacientes con cáncer, al menos uno de estos pasos no funciona correctamente. Nosotros y otros demostramos que las células cancerosas buscan detener la respuesta inmune evolucionando hacia variantes más agresivas y con privilegios inmunológicos 3,4,5 o dificultando la efectividad de las células T 6,7.

Tanto la investigación como el desarrollo de fármacos oncológicos se basan en modelos experimentales que permiten estudiar la relación entre el cáncer y las células inmunitarias, la llamada oncoinmunología. A continuación se describen modelos in vitro rápidos, fiables, reproducibles y de bajo coste que reproducen de forma exhaustiva cada paso del ciclo onco-inmunológico y ofrecen una visión rápida y clara de los conjuntos de características fenotípicas y funcionales de la inmunovigilancia y, finalmente, de la inmunoedición.

La citometría de flujo multiparamétrica (mFC) es una de las herramientas analíticas unicelulares más exitosas en la investigación fundamental, el diagnóstico y la investigación traslacional del cáncer en ensayos clínicos del cáncer. Dado que permite capturar simultáneamente más características en cada célula, mFC se ha ganado su lugar como una plataforma de análisis de referencia en oncoinmunología. Combina una alta sensibilidad y especificidad con la posibilidad de medir múltiples patrones de expresión de proteínas y propiedades funcionales de forma rápida y reproducible a nivel de una sola célula a partir de suspensiones celulares heterogéneas e incluso heterotípicas, como las del TME 8,9,10. Dado que tanto los patrones de expresión fenotípicos como los funcionales son sensibles al tiempo, la atención cuidadosa al diseño del experimento, la selección de paneles, controles y anticuerpos titulados adecuados, así como el procesamiento de la muestra y el uso adecuado de la instrumentación son fundamentales para la fiabilidad, comparabilidad y reproducibilidad de los resultados y para interpretar con confianza el resultado del experimento11.

Los dispositivos microfluídicos (ToC) de tumores en un chip modelan el TME al permitir la biomimética a microescala in vitro de la dinámica e interacciones entre el cáncer y las células inmunitarias 12,13,14,15. En concreto, los ToCs son dispositivos de cultivo celular microfluídicos multicanal capaces de albergar diversos tipos de células organizadas en entornos de cultivo bidimensionales (2D) o tridimensionales (3D) y capaces de modelar con alta fidelidad y controlar con alta precisión, unidades estructurales y funcionales clave, como las interacciones celulares heterotípicas y los flujos de gradientes químicos que ocurren fisiológicamente en el TME12, 13,14,15. En particular, la quimioatracción y las trayectorias inmunitarias, así como la interacción de las células inmunitarias con las células cancerosas, pueden monitorizarse en tiempo real y cuantificarse mediante microscopía de lapso de tiempo y análisis de seguimiento automatizado 5,12,13,14,15,16. Además, las TdC ofrecen la posibilidad de analizar y manipular procesos cruciales que regulan la aparición y progresión del cáncer y la respuesta a la terapia17.

En este artículo, se combinan mFC con ToCs para estudiar todos los niveles de la respuesta inmune anticancerígena que pasan por la fagocitosis mediada por DC de las Ags cancerosas (pasos 1-3), el cebado cruzado de células T (paso 4), la activación y expansión clonal (esta última mediante la tecnología de cicloadición catalizada por 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) y Cu(I), una metodología altamente sensible y precisa, paso 5), la localización de célulasE CD8 en el TME (paso 6) y, finalmente, la destrucción de células cancerosas mediada por célulasE CD8 (paso 7, Figura 1).

Este trabajo contribuye al esfuerzo por establecer protocolos estándar simples, rápidos y confiables para estudiar el ciclo de inmunidad al cáncer. La mejora e integración de los modelos mFC y ToC en la investigación del cáncer, la dinámica de la EMT y la respuesta a la terapia tienen un gran potencial, ya que estos modelos proporcionan fidelidad biológica junto con el control experimental. Por lo tanto, este protocolo ayuda a recrear, de manera escalonada, el ciclo de inmunidad al cáncer al permitir caracterizar, monitorear y maniobrar oportunamente los roles de los actores celulares individuales y sus interacciones recíprocas sobre la inmunovigilancia natural y adquirida. En última instancia, esto ayudará a refinar, reducir y reemplazar los estudios en animales, al tiempo que proporcionará información crítica para burlar a los tumores y guiar la atención clínica. Por último, las ventajas y limitaciones de mFC y ToC se discuten críticamente y se comparan con las tecnologías de vanguardia (por ejemplo, análisis espaciales de alta complejidad a una sola célula e incluso a resolución subcelular) para impulsar la investigación y el tratamiento oncoinmunológicos.

Protocol

Todos los pasos del protocolo que requieren el uso de animales cumplen con la Directiva de la UE 63/2010 y están incluidos en un protocolo experimental aprobado por el Comité Institucional de Experimentación Animal y el Ministerio de Salud italiano (número de aprobación 858/2015/PR). 1. Preparación de las células cancerosas Rutina de cultivo de células cancerosas (día -7; duración: 2 h)Cultive células murinas de fibrosarcoma MCA205 en un medio de crecimiento Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% (v/v), 2 mM de L-glutamina, 100 UI/mL de sal sódica de penicilina G, 100 μg/mL de sulfato de estreptomicina y 50 μg/mL de higromicina (medio de crecimiento completo), en una incubadora de cultivo celular humidificada en condiciones de cultivo estándar (37 °C, 5% CO2).NOTA: Adapte las condiciones de cultivo de acuerdo con la línea celular de elección. En caso de descongelación, las células necesitan ~1 semana de tiempo de recuperación para adaptarse a las condiciones óptimas de cultivo y restablecer los ciclos celulares normales. Para optimizar el crecimiento del cultivo celular, coloque las células enplacas en matraces de 75 cm 2 a una densidad de 1 x 106 células/mL en 12-15 mL de medio de crecimiento completo.NOTA: El número de células sembradas puede variar en las diferentes líneas celulares, generalmente dependiendo del tamaño específico de la célula y el tiempo de duplicación. La confluencia celular influye drásticamente en el estado de las células. Si las células son poco o demasiado confluentes, pueden producirse perturbaciones metabólicas que favorezcan la detención proliferativa, la selección clonal o el estrés celular. En el caso de las células MCA205, el paso debe realizarse dos veces por semana en una relación de división de 1:10-1:20. Cuando los cultivos celulares alcancen una confluencia máxima del 75%-80%, desechar el medio de crecimiento completo de la monocapa celular, lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) precalentada para eliminar el FBS y, a continuación, añadir 1,5 ml de tripsina/ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) precalentado al 0,25% durante 1-2 min a 37 °C para separar las células.NOTA: FBS contiene inhibidores de la proteasa que pueden inactivar la actividad enzimática de la tripsina, por lo tanto, su eliminación completa es un paso crucial. El tiempo de incubación de la tripsina difiere según el tipo de célula. Como pauta general, evite la incubación a largo plazo de células con alta concentración de tripsina, ya que puede rayar las proteínas de la superficie celular y desencadenar la muerte celular. En este paso, verifique el estado de desprendimiento de células con un microscopio óptico. Recoja las células desprendidas en 10 mL de medio de crecimiento completo precalentado para inactivar la actividad enzimática de la tripsina y centrifugue durante 5 min a 1100 × g a temperatura ambiente (RT). Cuente las células en un portaobjetos de recuento de células utilizando la prueba de exclusión de colorante azul de tripán y luego vuelva a sembrarlas después de la dilución en soportes apropiados para el cultivo de mantenimiento (no más de 8 pasos desde la descongelación) o para procedimientos experimentales posteriores, como se detalla a continuación. Muerte de células cancerosas: liberación de Ags de células cancerosas (día 0; duración: 30 min)Para experimentos funcionales posteriores, placa 3 × 106 células MCA205 en una placa de Petri tratada con cultivo de tejidos de 100 mm en 10 mL de medio de crecimiento completo.NOTA: Para aplicaciones experimentales específicas (por ejemplo, análisis de la absorción de Ag tumoral mediada por DC), antes de inducir la muerte celular, las células cancerosas se han marcado mediante el uso de un enlazador de células fluorescentes (Tabla de materiales), según las instrucciones del fabricante. Irradiar las células con luz ultravioleta (UV)18 (ƛ = 254 nm) a una distancia de 9 cm durante 3 min y luego incubarlas a 37 °C, 5% CO2 durante al menos 6 h para dejarlas morir.NOTA: La muerte de las células cancerosas también puede ser inducida por tratamiento quimioterapéutico (por ejemplo, medicamentos inmunogénicos o no inmunogénicos5). 2. Cocultivo de células cancerosas e inmunitarias Captación y presentación de Ag oncológico mediado por DC (día 0; Tiempo: 1 h de tiempo de banco, 24 h de tiempo de incubación)Después de 4-6 h, recoja las CD, in vitro diferenciadas de las células de la médula ósea (MO) de ratones inmunocompetentes como se describió anteriormente8, y lávelas dos veces durante 5 min a 1100 x g a RT en medio de crecimiento completo.NOTA: Las CD pueden aislarse alternativamente de los esplenocitos de ratón por centrifugación en un gradiente basado en Histodenz, como se informó anteriormente19. Como buena práctica, si se utilizan CD criopreservadas, asegúrese de precalentar todo el medio de crecimiento y suplementarlo con benzonasa 1:1000 para evitar la aglomeración de células y así asegurar una buena recuperación tras la descongelación. Recoja las células cancerosas irradiadas con UV del paso 1.2.2 y centrilécelas durante 5 min a 1100 x g en RT. Cuente las células cancerosas “vacías” derivadas de BM (DCN) como se indicó anteriormente (consulte el paso 1.1.4) y luego configure el cocultivo con células apoptóticas irradiadas con UV en una proporción de 2:1 (5 × 105 células MCA205 apoptóticas para 2,5 × 105 DC, como se optimizó anteriormente8) en placas de 12 pocillos en 1 mL de medio de crecimiento completo fresco durante 24 h a 37 °C, 5% deCO2. Como controles experimentales, incubar las células a 4 °C, una condición en la que la fagocitosis se ve obstaculizada.NOTA: No aumente la superficie y el volumen del cocultivo, ya que esto podría dificultar las interacciones entre las células cancerosas apoptóticas y las DC y, por lo tanto, impedir una fagocitosis óptima y eficaz. Además, es necesario realizar estudios para optimizar la relación entre células cancerosas y células cancerosas si se utilizan otros modelos de células cancerosas. Evaluación de la captación de Cancer Ag por mFC (día 1; duración: 2 h)A las 24 h de incubación, recoja las células en tubos de 15 mL y lávelas dos veces durante 5 min a 1100 x g a RT en 10 mL de medio de crecimiento completo.NOTA: Para reducir el ruido de fondo de las células apoptóticas adheridas a la membrana de CC y que aún no se han engullido por completo, los gránulos de células se incuban durante 5 min a RT con 0,1 M de EDTA. A continuación, las suspensiones celulares (que contienen aproximadamente 2 x 106 células) se centrifugan dos veces con 10 ml de medio de crecimiento, como en el paso 2.2.1. Para la tinción de la superficie celular, resuspenda las CD derivadas de BM en 20 μL de tampón de clasificación celular activado por fluorescencia fría (FACS) (1% FBS, 0,1 M EDTA en PBS) que contenga 0,5 μg de CD11c conjugado con infotipo de IgG o con ficoeritrina (PE) en una microplaca tratada con cultivo de tejido de fondo en forma de U de 96 pocillos e incubarlas durante 20 minutos a 4 °C en la oscuridad para preservar la señal de fluorocromo y evitar el fotoblanqueo.NOTA: Una vez que se produce la absorción del antígeno canceroso, también se puede verificar la activación “completa” de DC (DCPHAGO) mediante la verificación de los niveles de expresión de las moléculas coestimuladoras (es decir, CD80 o CD86 y MHC-II y del ligando de punto de control inmunitario antígeno CD274 [más conocido como PDL1]). Como regla general, para un rendimiento óptimo del citómetro de flujo, la concentración de anticuerpos debe valorarse cuidadosamente y el número de células debe oscilar entre 1 x 105 y 1 x 108 células/prueba. A continuación, lavar las células dos veces en el tampón FACS y añadir 100 μL de una solución de PBS que contenga un colorante de infrarrojo cercano (IR) fijable por vitalidad a una concentración final de 1 μM durante 30 min en RT.NOTA: Como alternativa, se pueden utilizar otros tintes fijables por vitalidad (por ejemplo, violeta, azul, naranja, lima, agua) que no se superpongan con las emisiones de fluorescencia utilizadas. Lave las células una vez en PBS y vuelva a suspenderlas en el tampón FACS antes del análisis citométrico de flujo de los niveles de CD11c y PKH67 mediante mFC. Durante la adquisición de mFC y, a continuación, en el análisis de datos, proceda con la siguiente estrategia de compuerta:Identifique las celdas de interés en función de sus propiedades de área de dispersión frontal (FSC-A, eje x) y área de dispersión lateral (SSC-A, eje y) (puerta 1). Excluya los dobletes y grupos de celdas del análisis trazando FSC-A (eje x) y la altura de dispersión directa (FSC-H, eje y, puerta 2). Elimine las celdas muertas trazando el área de filtro de paso de banda de emisión (bp) de 780/60 nm (eje x) y SSC-A (eje y, puerta 3). Por último, basado en la puerta 3 detecte la positividad celular para el marcador CD11c y el enlazador de células fluorescentes PKH67 en gráficos de densidad de dos parámetros mediante el uso de filtros bp de emisión de 575/26 nm y 530/30 nm, respectivamente. Realizar análisis de datos.NOTA: Asegúrese de combinar anticuerpos para garantizar un etiquetado fácil y eficiente con longitudes de onda de emisión bien separadas. Esto simplifica el ajuste de la compensación para los fluoróforos utilizados y permite una cuantificación fácil, rápida y fiable de los parámetros de interés. Cebado y activación de los linfocitos T CD8 (día 1; Duración: 1 h de banco, 72-96 h de incubación)Purificar los linfocitos T CD8 esplénicos murinos (CD8N) como se ha descritoanteriormente 8. Contar y resuspender los linfocitos T CD8 aislados en 500 μl de medio de crecimiento completo fresco y cultivarlos con CD derivadas de BM que previamente habían absorbido células MCA205 apoptóticas en una proporción de 2,5:1 (2,5 × 105 CD para 1 × 105 células T, como se había optimizado previamente8) durante 72 h en placas de 12 pocillos en un volumen final de 1,5 ml a 37 °C. 5% deCO2.NOTA: Para enfatizar los resultados experimentales, se han probado diferentes proporciones de cultivo celular y se ha elegido la mejor. Análisis de proliferación de linfocitos T CD8 mediante el ensayo EdU mFC (día 4; Duración: 15 min de banco, 16-20 h de incubación)Añadir el análogo de nucleósido a la timidina EdU al medio de cocultivo a una concentración final de 10 μM y mezclar bien.NOTA: Dado que las condiciones de cultivo, las variaciones del tipo de célula y la densidad celular pueden afectar la incorporación de EdU en el ADN, pruebe un rango de concentraciones de EdU y tiempos de incubación en experimentos piloto. Las incubaciones más largas o más cortas pueden requerir concentraciones más bajas o más altas, respectivamente. Incluir células de la misma población que no hayan sido tratadas con EdU como control de tinción negativo. Después de 16-20 h, recupere y centrifugue CD8C-P dos veces durante 5 min a 1100 x g en RT. Teñir las células para los marcadores de superficie en 20 μL de tampón FACS frío suplementado con 0,5 μg de CD8a conjugado con isotiocianato de fluoresceína anti-ratón (FITC) y 0,25 μg de CD3 conjugado con PE anti-ratón o con los respectivos controles de isotipo de IgG en una microplaca de 96 pocillos con fondo en forma de U tratada con TC e incubarlas durante 20 min a 4 °C en la oscuridad.NOTA: Para evitar cualquier interferencia, se recomienda no utilizar conjugados de anticuerpos Qdot antes de realizar la reacción de clic. Lave las células dos veces en tampón FACS (como en el paso 2.2.3) y vuelva a suspender los gránulos celulares en 100 μL de una solución de PBS que contenga el colorante Aqua fijable por vitalidad a una concentración final de 1 μM durante 30 min en RT.Transfiera las suspensiones celulares a tubos de flujo, lávelas una vez con 3 mL de albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en PBS y proceda con la fijación celular en 100 μL de un fijador (es decir, paraformaldehído al 4% en PBS) durante 15 min en RT, protegido de la luz. Inmediatamente después, lavar las células una vez con 3 mL de BSA al 1% en PBS, incubarlas en 100 μL de una solución que contenga 1x permeabilización a base de saponina y reactivo de lavado durante 15 min en RT, y luego pasar directamente a la reacción de marcado.NOTA: El reactivo de permeabilización y lavado a base de saponinas 1x se prepara diluyendo un volumen de solución 10x 1:10 con 1% de BSA en PBS. Este reactivo también se puede utilizar con suspensiones celulares que contienen sangre entera o glóbulos rojos, ya que conserva las características morfológicas de dispersión de la luz de los leucocitos mientras lisa los glóbulos rojos. De acuerdo con el número de muestras a analizar, prepare el cóctel de reacción mezclando suave y secuencialmente los volúmenes indicados de PBS, catalizador protector de cobre, azida de picolilo conjugada Alexa Fluor (AF) 647 y 1x aditivo tampón EdU.Use el cóctel de reacción dentro de los 15 minutos posteriores a la preparación. Agregue 500 μL de la mezcla de reacción a cada tubo, mezcle bien e incube durante 30 minutos a RT en la oscuridad. Lave las células una vez con 3 mL de permeabilización y reactivo de lavado a base de saponina 1x, y vuelva a suspenderlas en 100 μL de la misma solución antes de continuar con los métodos estándar de mFC para determinar el porcentaje de CD8C-P proliferante en fase S en la población celular por medio de mFC. Durante la adquisición de mFC y, a continuación, en el análisis de datos, proceda con la siguiente estrategia de compuerta:Identifique las celdas de interés en función de sus propiedades FSC-A (eje x) y SSC-A (eje y) (puerta 1). Excluya los dobletes y grupos de celdas del análisis trazando FSC-A (eje x) y FSC-H (eje y, puerta 2). Elimine las celdas muertas trazando el área del filtro bp de emisión de 525/50 nm (eje x) y SSC-A (eje y, puerta 3). Detecte la positividad celular para CD8a y CD3 en gráficos de densidad de dos parámetros mediante el uso de filtros bp de emisión de 530/30 nm y 575/26 nm, respectivamente (puerta 4). Finalmente, sobre la base de la puerta 4, analice más a fondo las celdas para la incorporación de AF647-EdU como intensidad fluorescente media en un histograma de un solo parámetro utilizando un filtro de emisión bp de 660/620 nm.NOTA: La señal fluorescente generada por el etiquetado de EdU se detecta mejor utilizando un caudal bajo durante la adquisición. Realizar análisis de datos. 3. Reestimulación de CD8C-P con células cancerosas CD8C-P reconoce las células cancerosas vivas (día 4; Duración: 1 h de banco, 48-72 h de incubación)Recuperar CD8C-P del cocultivo (consultar el paso 2.3.2) y centrifugarlas durante 10 min a 1100 x g a RT en 10 mL de medio de crecimiento completo.NOTA: En este paso, verifique la diferenciación de las células T CD8 comprobando los niveles de expresión del marcador de activación CD95. Resuspenda los gránulos de células, que contienen aproximadamente 2,5 × 106 células, en 100 μL de microesferas de eliminación de células muertas por 1 x 107 células totales.NOTA: Para un mayor número de células, amplíe el reactivo y los volúmenes totales en consecuencia. Mezclar bien e incubar durante 15 min a RT.NOTA: Si es necesario, el volumen de la muestra se ajusta agregando 1x tampón de unión, según las instrucciones del fabricante, para lograr un mínimo de 500 μL requerido para la separación magnética. Inmediatamente después, proceda con la separación posterior de las células magnéticas. Coloque las columnas de separación en el campo magnético de un separador adecuado y enjuáguelas con la cantidad adecuada de tampón de unión 1x. Transfiera las suspensiones celulares a columnas de separación y recoja el flujo que contiene la fracción de células vivas sin marcar. Vuelva a lavar las columnas con la cantidad adecuada de tampón de encuadernación 1x. Recoja las celdas no marcadas que pasan a través de ellas y combínelas con el efluente del paso 3.1.4.NOTA: Para aumentar la eficiencia de la eliminación magnética de las células muertas, la fracción de células vivas puede enriquecerse mediante un segundo procedimiento de separación, como se describe en los pasos 3.1.1-3.1.5, utilizando una nueva columna. Centrifugar CD8C-P vivo enriquecido con una dosis de 5 min a 1100 x g en RT en un medio de crecimiento completo antes del recuento de células y, a continuación, cultivarlas con células MCA205 frescas en una proporción de 2:1 (1 x 105 células T CD8 para 5 x 104 células MCA205, como se había optimizado previamente8) en 12 placas de pocillos con un volumen final de 1 mL. Después de la siembra celular, coloque las placas de cocultivo en una incubadora de cultivo celular humidificada o en un sistema de análisis de células vivas durante 72 h a 37 °C, 5% de CO2, antes de continuar con los ensayos posteriores. Tráfico de linfocitos T CD8 hacia las células cancerosas en modelos microfluídicos de ToC (día 5; Duración: 2 h de banco, 72 h de incubación)Esterilice los dispositivos microfluídicos ToC fabricados ad hoc 13,20 bajo una cabina UV durante 20 minutos, lave dos veces con PBS y luego incube con un medio de crecimiento completo durante al menos 1 h.NOTA: Las células MCA205 y CD8C-P no se tiñen en este protocolo; Sin embargo, ambos pueden marcarse con rastreadores celulares fluorescentes compatibles con vivos. Resuspender suavemente 1 × 105 células MCA205 en 15 μL de medio de crecimiento completo, teniendo cuidado de obtener una distribución celular homogénea, e inyectarlas lentamente en las cámaras de chips del lado izquierdo (cámara tumoral) como se describió anteriormente. Espere de 5 a 10 minutos para que las células cancerosas se adhieran al sótano del chip.Comprobar la distribución correcta y homogénea de las células cancerosas en el chip microfluídico bajo un microscopio. Los resultados experimentales pueden verse afectados por la presencia de burbujas. Resuspenda 1 x 106 CD8C-P en 50 μL de medio de crecimiento completo. Pipetee suavemente la suspensión de células inmunitarias en las cámaras de chips del lado derecho (cámara inmunitaria).NOTA: En este paso, utilice un microscopio para confirmar que las células inmunitarias se distribuyen en la cámara intermedia, creando un “frente”, que representa el punto de partida del experimento. Para evitar fluctuaciones de presión y microfluídicas, llene cuidadosamente todos los depósitos de virutas como se indicó anteriormente13 con hasta 150 μL de medio de crecimiento completo y coloque las virutas ensambladas en una superficie nivelada en una incubadora de cultivos celulares humificados a 37 °C, 5% de CO2 durante al menos 1 h para estabilizar el sistema antes de las grabaciones de lapso de tiempo.NOTA: Revise cuidadosamente las posibles pérdidas evaporativas de volúmenes en los dos depósitos de cada cámara de virutas y compénselas agregando medio fresco cada 2 a 3 días. Si es necesario, se pueden aspirar hasta 100 μL de sobrenadantes de cada compartimento celular para realizar el perfil de citocinas. Utilice la configuración de microscopía de video equipada con un sistema de incubación para registrar series de imágenes de campo claro de la matriz de microcanales entre las regiones derecha e izquierda del dispositivo que contienen MCA205 y células inmunitarias, respectivamente, y para visualizar la dinámica de la infiltración de células inmunitarias y la interacción entre células inmunitarias y células cancerosas.NOTA: En el entorno experimental utilizado aquí, se recogieron grabaciones de lapso de tiempo de las células en la incubadora durante 72 h con un microscopio que adquiría una microfotografía cada 2 min. Optimice las condiciones de imagen para evitar una exposición fotográfica excesiva y tener una alta velocidad de fotogramas de adquisición con el fin de realizar fácilmente análisis de seguimiento de células inmunitarias posteriores. Al final del lapso de tiempo, realice un análisis de seguimiento semiautomático13,20. Activación de CD8E y evaluación citométrica de flujo de reactividad tumoral (día 7 y 8; Duración: 2 h)Después de 48 y 72 h de incubación (ver paso 3.1.6), recuperar CD8E y centrifugar dos veces durante 5 min a 1100 x g a RT.NOTA: Para evaluar los niveles intracelulares de moléculas citotóxicas producidas por CD8E (es decir, IFN-γ y Grz-B), se han incubado previamente cocultivos de células inmunitarias cancerosas durante al menos 6 h con brefeldina A 1:1000 y monensina 1:1500. Para la tinción de la superficie celular, vuelva a suspender las células en 20 μL de tres mezclas diferentes de anticuerpos primarios preparadas en tampón FACS frío, como se muestra en la Tabla complementaria 1.NOTA: Para garantizar la especificidad de la unión de anticuerpos, lleve a cabo experimentos con mFC en presencia de controles apropiados del isotipo de IgG, como se indica en el paso 2.2.2. Incubar las células en una microplaca de cultivo de tejido inferior en forma de U de 96 pocillos tratada durante 20 minutos a 4 °C, protegida de la luz. Para los pellets de celda de las mezclas A y B (Tabla suplementaria 1), proceda directamente al paso 3.3.5. Después de un lavado rápido, añadir 100 μL de solución de fijación/permeabilización a los gránulos celulares de la mezcla C (Tabla suplementaria 1). Tras una incubación de 20 min a 4 °C en la oscuridad, lavar las células dos veces en 200 μL de tampón de permeabilización/lavado en frío y resuspenderlas en 20 μL de tampón de permeabilización/lavado en frío que contenga 0,25 μg de IFN-γ conjugado con FITC anti-ratón y 0,125 μg de Grz-B conjugado con PE anti-ratón o con los respectivos isotipos de IgG. Incubar las células durante 30 min a 4° C, protegidas de la luz. A continuación, lavar las células dos veces en tampón FACS y añadir a los gránulos de las células 100 μL de una solución de PBS que contenga el colorante Aqua fijable por vitalidad a una concentración final de 1 μM durante 30 min en RT (como en el paso 2.2.4). Lave las células una vez en PBS y vuelva a suspenderlas en el tampón FACS antes del análisis citométrico de flujo de la activación de las células T CD8 contra las células cancerosas mediante un mFC. Durante la adquisición de mFC y, a continuación, en el análisis de datos, proceda con la siguiente estrategia de compuerta:Identifique las celdas de interés en función de sus propiedades FSC-A (eje x) y SSC-A (eje y) (puerta 1). Excluya los dobletes y grupos de celdas del análisis trazando FSC-A (eje x) y FSC-H (eje y, puerta 2). Elimine las celdas muertas trazando el área del filtro bp de emisión de 525/50 nm (eje x) y SSC-A (eje y, puerta 3). Detecte la positividad celular para CD8a y CD3 en gráficos de densidad de dos parámetros mediante el uso de filtros bp de emisión de 660/20 nm y 780/60 nm o 530/30 nm y 575/26 nm (puerta 4). Por último, sobre la base de la puerta 4, analice más a fondo las celdas en gráficos de densidad de dos parámetros para los marcadores CD44 (filtro bp de emisión de 530/30 nm), CD25 (filtro bp de emisión de 575/26 nm) y CD69 (filtro bp de emisión de 450/50 nm) para el marcador CD137 (filtro bp de emisión de 660/20 nm) y para IFN-γ (filtro bp de emisión de 530/30 nm) y Grz-B (filtro bp de emisión de 575/26 nm) para la mezcla A, B y C (Tabla Suplementaria 1), respectivamente.NOTA: La reactividad tumoral de las célulasE CD8 se puede evaluar más mediante la evaluación de la expresión superficial de la proteína asociada al lisosoma CD107a mediante un ensayo de degranulación ad hoc . Realizar análisis de datos. Investigación de la destrucción tumoral mediada por células CD8E mediante un sistema de análisis de células vivas y mFC (día 8; Duración: 1 h de banco, 72 h de incubación)Para el ensayo de destrucción tumoral por medio de un sistema de análisis de células vivas, complementar el medio de cocultivo (ver paso 3.1.6) con un colorante de cuantificación de la muerte celular en tiempo real a una concentración final de 250 nM. Después de colocar las placas de cocultivo en el sistema de análisis de células vivas, deje que la placa se caliente a 37 °C durante 30 minutos antes de la exploración. Realice un escaneo de datos cada 2 h hasta 72 h para recopilar grabaciones de lapso de tiempo, que serán analizadas por los softwares adecuados. Para el ensayo de destrucción tumoral con mFC, 72 h más tarde (ver paso 3.1.6), recolecte y centrifugue las células dos veces durante 5 min a 1100 x g en RT. Teñir las células de los marcadores de superficie en 20 μL de tampón FACS frío que contiene 0,125 μg de control de isotipo IgG o CD45 conjugado con azul pacífico (PB) anti-ratón en una microplaca de 96 pocillos con fondo en forma de U tratada con TC e incubarlas durante 20 min a 4 °C en la oscuridad. Inmediatamente después, lavar las células dos veces en el tampón FACS y añadir el colorante de vitalidad yoduro de propidio (PI) a una concentración final de 1 μM antes del análisis por citometría de flujo. Durante la adquisición de mFC y, a continuación, en el análisis de datos, proceda con la siguiente estrategia de compuerta:Identifique las celdas de interés en función de sus propiedades FSC-A (eje x) y SSC-A (eje y) (puerta 1). Excluya los dobletes y grupos de celdas del análisis trazando FSC-A (eje x) y FSC-H (eje y, puerta 2). Detecte células cancerosas para la negatividad de CD45 utilizando un filtro bp de emisión de 450/50 nm (puerta 3). Finalmente, analice las células para la incorporación de PI como intensidad fluorescente media en un histograma de un solo parámetro utilizando un filtro de emisión de 610/620 nm bp.NOTA: La muerte de las células cancerosas también se puede analizar mediante la realización de un ensayo de apoptosis de anexina V-PI o mediante la evaluación de los niveles de expresión de caspasas-3 y -7 escindidas. Realizar análisis de datos.NOTA: Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Prism GraphPad v.8.4.0.

Representative Results

Se evaluó la capacidad de las CD CD11c+, el subconjunto de fagocitos ampliamente conocido especializado en la presentación cruzada21,22 y activado como se muestra en la Figura 2A, para engullir cuerpos apoptóticos de células cancerosas MCA205 irradiadas con UV que fueron previamente marcadas con el enlazador de células fluorescentes PKH67 mediante mFC. Como era de esperar, las CD CD11c+ capturaron eficiente…

Discussion

El seguimiento de la respuesta inmunitaria contra el cáncer es de suma importancia para dilucidar y comprender las intrincadas interacciones moleculares y celulares que actúan en la EMT y respaldan una batalla constante por la supremacía23. A continuación, detallamos un protocolo sencillo asistido por mFC y ToC para el seguimiento y la caracterización de los pasos que constituyen el ciclo cáncer-inmunidad. Con pequeñas variaciones, este protocolo, basado en líneas celulares murinas y célu…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A.S. está soportado por AIRC (IG #28807) y por PRIN (#P2022YE2MX). M.M. cuenta con el apoyo de la beca AIRC-FIRC (#25558). A.D.N. cuenta con el apoyo del Ecosistema de Innovación Rome Technopole ECS00000024 financiado por la UE – Next Generation EU, PNRR Mission 4 Component 2 Investment 1.5.

Materials

1.5 mL microtubes  Eppendorf 30120086
100 kV e-beam litography Vistec
100 mm Petri dishes  Greiner Bio One 664160
12-well plates Euroclone  ET3012
15 and 50 mL tubes Corning  352096; 352070
40 μm cell strainer  Corning  CLS431750
5 mL polystyrene tubes  Greiner Bio-One 120180
70 μm cell strainer  Corning  CLS431751
75 cm2 cell culture treated flask Euroclone  ET7076
Adsorbent wipes
Allumin foil
anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody Miltenyi Biotec 130-111-319
anti-mouse CD25 (7D4) Antibody  Miltenyi Biotec 130-118-678
anti-mouse CD3 (17A2) Antibody BioLegend 100206
Aptes Sigma Aldrich 440140
BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug BD Biosciences 555028
BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A) BD Biosciences 555029
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) BD Biosciences 554724
Bovine serum albumin (BSA) US Biological, Salem A1312
CD11c Monoclonal Antibody (N418) eBioscience 12-0114-81
CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5) eBioscience 17-1371-82
CD3 Monoclonal Antibody (17A2) eBioscience 25-0032-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7) eBioscience 11-0441-82
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) Invitrogen MCD4528
CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3) eBioscience 48-0691-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) eBioscience 11-0081-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) eBioscience 17-0081-82
CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7) eBioscience 53-0951-82
Cell counting slides Kova International 87144E
Chromium quartz masks MB W&A, Germany
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit Invitrogen C10635
CytoFLEX Flow Cytometer Beckman Coulter
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) EuroClone ECB4053L
EDTA Invitrogen AM9260G
Fetal bovine serum (FBS) EuroClone ECS0180L
Flowjo v10.0.7 Flowjo, LLC
Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB) eBioscience 12-8898-82
H2O2 Sigma Aldrich
H2SO4 Sigma Aldrich
hotplate
Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2) Thermo Scientific
Ice machine Brema Ice Makers
IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2) eBioscience 11-7311-82
Illustrator CC 2015 Adobe Systems Inc.
ImageJ National Institute of Health
Incucyte 2022A Software Sartorius
Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells Sartorius 4632
Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System  Sartorius
JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope Bulldog Bio
Laboratory bench
Laboratory refrigerator (4°C)
Laboratory Safety Cabinet (Class II) Angelantoni
L-glutamine 200 mM EuroClone ECB3004D
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Invitrogen L34957
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Invitrogen L10119
MACS columns Miltenyi Biotec 130-042-201; 130-042-401 
MACS separators Miltenyi Biotec 130-042-10; 130-042-302
MCA205 mouse fibrosarcoma cell line Sigma-Aldrich SCC173
Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine
MicroCL 21R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002552
Microsoft Excel  Microsoft, Redmond 
Mouse: C57BL/6J The Jackson Laboratory 000664
Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyi Biotec 130-096-543
Nikon ECLIPSE Ts2 Nikon Instruments Inc.
NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT Nikon Instruments Inc.
Optical litography EVG
Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate EuroClone ECB3001D/1
Pipet aid Drummond Scientific Co., Broomall, PA  4-000-201
Pipettes Eppendorf
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits Sigma-Aldrich PKH67GL-1KT fluorescent cell linker  kit
plastic coverslip IBIDI 10812
Propidium Iodide Thermo Scientific P1304MP
Reactive Ion Etching system Oxford plasmalab
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) EuroClone ECB9006L
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) Corning- Millipore-Sigma; St. Louis,
MO
CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489
SL 16 Centrifuge Series Thermo Scientific 75004031
Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers
Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL) EuroClone Spa, Milan, Italy ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005
SU-8 3000 series MicroChem corp, Newton, (MA)
Suite of dermal biopsy punches Kai Medical, Tedpella
Sylgard 184 Dowsil, Dow Corning 101697
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597) eBioscience 12-5961-82
Thermostatic bath
Timer
TMCS  Sigma Aldrich 92360
Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Scientific 15250061
Trypsin-EDTA w/ Phenol Red EuroClone ECM0920
Vacuum dessicator

Referencias

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Citar este artículo
Manduca, N., Maccafeo, E., De Ninno, A., Sistigu, A., Musella, M. Co-Culture In Vitro Systems to Reproduce the Cancer-Immunity Cycle. J. Vis. Exp. (208), e66729, doi:10.3791/66729 (2024).

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