Este protocolo presenta una guía paso a paso para que los investigadores realicen el procedimiento de oclusión de la arteria cerebral media en ratones utilizando el método modificado de la arteria carótida externa de Longa. Las modificaciones presentadas en este artículo tienen como objetivo aumentar la precisión de la oclusión de la arteria cerebral media y asegurar una reperfusión completa.
El modelo de oclusión de la arteria cerebral media sirve como modelo animal primario para estudiar el accidente cerebrovascular isquémico. A pesar de haberse utilizado en la investigación durante más de tres décadas, su estandarización sigue siendo inadecuada. El procedimiento, que se lleva a cabo principalmente en ratas y ratones, plantea desafíos debido a la naturaleza más pequeña y frágil de los ratones. A diferencia del método de la arteria carótida común de Koizumi, la arteria carótida externa de Longa es el único modelo de carrera de filamento intraluminal que garantiza una reperfusión completa después de la isquemia. Este aspecto tiene una importancia crítica para los estudios que investigan los fenómenos de reperfusión. Las modificaciones quirúrgicas demostradas en este artículo aseguran un flujo sanguíneo continuo desde la arteria carótida común durante toda la fase isquémica y después del inicio de la reperfusión. El objetivo de estas modificaciones es ocluir selectivamente la arteria cerebral media manteniendo la perfusión ininterrumpida en las ramas proximales a la arteria cerebral media durante el período de isquemia. Además, el inicio de la reperfusión es brusco y puede controlarse con precisión, lo que permite modelar con mayor precisión la trombectomía endovascular en medicina humana. Nuestro objetivo al presentar este completo videoartículo es facilitar la formación de nuevos cirujanos y promover la estandarización de los procedimientos quirúrgicos dentro de la comunidad científica.
El accidente cerebrovascular es la segunda causa de muerte y la tercera causa de muerte y discapacidad combinadas1. Por su causa, el ictus puede ser isquémico o hemorrágico, siendo el ictus isquémico significativamente más prevalente en la práctica clínica. El accidente cerebrovascular isquémico surge de una obstrucción en una arteria que suministra sangre al tejido cerebral, lo que provoca isquemia, muerte celular e inflamación. Desde el advenimiento de las terapias de reperfusión, como la trombólisis y la trombectomía mecánica, se han realizado grandes avances en el tratamiento del accidente cerebrovascular. Sin embargo, todas las terapias de reperfusión conllevan el riesgo de exacerbar la condición del paciente al causar lo que comúnmente se conoce como lesión por reperfusión2. El mecanismo exacto de la lesión por reperfusión sigue sin estar claro, y depende de los estudios preclínicos identificar las posibles causas y las medidas preventivas. Para ello, es crucial desarrollar un modelo animal pertinente para la lesión por reperfusión que sigue a un accidente cerebrovascular isquémico.
La oclusión de la arteria cerebral media (MCAO, por sus siglas en inglés) es el modelo animal más utilizado para estudiar el accidente cerebrovascular isquémico. Se lleva a cabo predominantemente en roedores y tiene muchas variantes diferentes descritas en la literatura científica hasta el momento 3,4. Los dos tipos principales, Koizumi y Longa, conocidos como variantes de la arteria carótida común (ACC) y de la arteria carótida externa (ECA), difieren técnicamente por el sitio de la arteriotomía para la inserción del filamento 5,6. En nuestro reciente artículo, mediante la monitorización in vivo de la perfusión vascular, demostramos que solo el método de Longa puede considerarse realmente un modelo de isquemia/reperfusión cerebral7. El procedimiento consiste en insertar el filamento en el ECA, hacerlo avanzar a través del ICA y asegurarlo en el punto de ramificación de la arteria cerebral media (MCA) para inducir la isquemia del tejido cerebral. Después de un período predeterminado de isquemia, la retirada del filamento permite la reperfusión, simulando una isquemia cerebral transitoria. Después del inicio del accidente cerebrovascular, la variable de resultado principal utilizada en la investigación suele ser el volumen de la lesión infartada, que puede medirse mediante histología ex vivo o gammagrafías cerebrales in vivo. Los desafíos en los modelos de MCAO giran en torno a la baja reproducibilidad atribuida a las varianzas intervariantes, interoperatorias e intersujetos, y estas últimas plantean una limitación significativa en la investigación preclínica del ictus4.
Además, las regiones infartadas que siguen a la MCAO en roedores son enormes en relación con el tamaño del cerebro del roedor. Además, las regiones posteriores del hipocampo del cerebro a menudo se reclutan en el volumen del infarto, a pesar de que esas regiones dependen principalmente del flujo sanguíneo de la arteria cerebral posterior (PCA) y no de la MCA8. Al igual que en los métodos de Koizumi y Longa descritos en la literatura, el CCA se mantiene ligado durante el período de isquemia debido a la permeabilidad incompleta del círculo de Willis en ratones, lo que lleva a la inducción de la isquemia en una región mucho más amplia de lo previsto 5,6,9. Incluso en los métodos en los que el ACC se reabre o se repara después del período de isquemia, los 30-60 min habituales de isquemia dan lugar a una lesión tisular irreversible en las regiones no MCA10. Además, contrariamente a lo esperado, investigaciones anteriores mostraron que la longitud del recubrimiento de silicona de un filamento no tiene ningún impacto en el tamaño de la lesión11. Sin embargo, la elección de la longitud del recubrimiento de silicona del filamento se abordó únicamente en modelos con CCA ligado durante el período de oclusión.
El objetivo de este método fue modificar el método de Longa MCAO en ratones para permitir el flujo sanguíneo ininterrumpido desde el CCA durante el período de isquemia, aumentando así la selectividad del MCAO, así como asegurando la reperfusión completa de la región infartada después del procedimiento. Estas modificaciones beneficiarían en gran medida a los estudios longitudinales que investigan la lesión por isquemia-reperfusión en ratones, ya que disminuirían la tasa de mortalidad y la varianza entre sujetos.
El MCAO es un procedimiento muy exigente para el operador y debilitante para el animal. Por esta razón, es de suma importancia que los investigadores cuenten con un procedimiento operativo estándar que minimice la gravedad del accidente cerebrovascular, reduzca el fracaso del procedimiento y mejore el bienestar del animal después del procedimiento. Este protocolo MCAO destaca algunos de los aspectos clave a tener en cuenta al realizar este procedimiento en un mouse.
<p class="jov…The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por el proyecto BRADISCHEMIA de la Fundación Croata para la Ciencia (UIP-2017-05-8082); GA KK01.1.1.01.0007 financiado por la Unión Europea a través del Fondo Europeo de Desarrollo Regional y por la Unión Europea a través del Fondo Europeo de Desarrollo Regional en virtud del Acuerdo de Subvención No. KK.01.1.1.07.0071, proyecto “SineMozak. El trabajo de los estudiantes de doctorado Rok Ister y Marta Pongrac ha sido totalmente respaldado por el “Proyecto de desarrollo de la carrera de jóvenes investigadores – formación de estudiantes de doctorado” de la Fundación Croata para la Ciencia, financiado por la Unión Europea del Fondo Social Europeo. El procedimiento fue filmado con un teléfono inteligente Android montado en un microscopio quirúrgico usando un soporte de cámara genérico. Los materiales de video fueron editados y la voz en off fue grabada usando el editor de video Wondershare Filmora.
Betadine cutaneous solution 10g/100ml | Alkaloid Skopje | N/A | |
Braided silk suture | Fine Science Tools | 18020-60 | |
Dafilon suture 5/0 DS16 | B. Braun | C0936154 | |
Dolokain 20 mg/g gel | Jadran-Galenski Laboratorij | N/A | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | 2 pieces |
Dumont #7 forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
Dumont N0 self-closing forceps | Fine Science Tools | 11480-11 | |
Durapore Surgical Tape 1,25cm x 9,1m | 3M | 7100057169 | |
Durapore Surgical Tape 2,5cm x 9,1m | 3M | 7100057168 | |
External thermostat | Petnap | 1012536 | |
Halsey needle holders | Fine Science Tools | 12500-12 | |
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | |
Iris scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
Isoflurane USP | Piramal critical care | N/A | |
Laser Doppler Monitor | Moor | MOORVMS-LDF2 | |
Metal Pet Heat Pad | Petnap | 1012525 | |
Micro Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Mini-colibri retractor | Fine Science Tools | 17000-01 | |
Recugel eye ointment | Bausch&Lomb | N/A | |
S&T B-1 vessel micro clamp | Fine Science Tools | 00396-01 | 2 pieces |
S&T micro clamp applying forceps | Fine Science Tools | 00071-14 | |
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Stemi DV4 Spot stereo microscope | Zeiss | 000000-1018-453 | |
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VetFlo Six Channel Anesthesia Stand | Kent Scientific | VetFlo-1225 | Modified for O2/N2 mixing |