Aislamiento, expansión y diferenciación de progenitores fibro-adipogénicos a partir del modelo de ratón espinoso
Summary
Este protocolo describe el aislamiento de progenitores fibroadipogénicos (FAPs) del músculo esquelético y cardíaco a partir de ratones espinosos (Acomys) mediante disociación enzimática y clasificación celular activada por fluorescencia. Los FAPs obtenidos de este protocolo pueden expandirse y diferenciarse eficazmente a miofibroblastos y adipocitos.
Abstract
Debido a su excepcional programa de reparación, el ratón espinoso es un modelo de investigación emergente para la medicina regenerativa. Los progenitores fibroadipogénicos son células residentes en tejidos que pueden diferenciarse en adipocitos, fibroblastos y condrocitos. Los progenitores fibroadipogénicos son fundamentales para orquestar la regeneración de tejidos, ya que son responsables de la remodelación de la matriz extracelular después de una lesión. Este estudio se centra en investigar el papel específico de los progenitores fibroadipogénicos en la reparación cardíaca y la regeneración del músculo esquelético del ratón. Con este fin, se ha optimizado un protocolo para la purificación de progenitores fibroadipogénicos de ratón espinoso mediante citometría de flujo a partir de músculo esquelético y cardíaco disociado enzimáticamente. La población obtenida de este protocolo es capaz de expandirse in vitro, y se puede diferenciar a miofibroblastos y adipocitos. Este protocolo ofrece una valiosa herramienta para que los investigadores examinen las propiedades distintivas del ratón espinoso y las comparen con el Mus musculus. Esto proporcionará información que podría avanzar en la comprensión de los mecanismos regenerativos en este intrigante modelo.
Introduction
Inicialmente reconocido por su piel excepcionalmente frágil y su notable capacidad para reparar lesiones cutáneas, el ratón espinoso ha demostrado una capacidad regenerativa superior en varios sistemas de órganos, como el musculoesquelético, el renal, el sistema nervioso central y el cardiovascular, en comparación con Mus musculus 1,2.
Los progenitores fibroadipogénicos (FAP) son un subconjunto de células estromales que residen en varios tejidos, incluidos el músculo esquelético y el cardíaco. Estas células poseen una capacidad única para comprometerse con linajes fibrogénicos y adipogénicos in vivo e in vitro 3,4. Las FAPs desempeñan un papel crucial en la regeneración de tejidos al modular la matriz extracelular y apoyar las funciones de otros tipos de células involucradas en el proceso de reparación. En el músculo esquelético, las FAP se activan en respuesta a una lesión y facilitan la diferenciación y miogénesis de las células madre musculares 5,6. En la lesión isquémica del corazón, los FAP depositan tejido cicatricial para mantener la integridad del miocardio. A diferencia de los músculos, las FAP cardíacas se activan crónicamente y contribuyen a la remodelación patológica 7,8.
Estudios previos han demostrado que la matriz extracelular espinosa del ratón tiene una composición, estructura y propiedades diferentes que apoyan la regeneración en comparación con Mus musculus 9,10. En las lesiones musculares y cardíacas, se ha observado que los FAP contribuyen a una curación superior en ratones espinosos 11,12,13. Comprender el comportamiento y el control regulatorio de los FAP y el estroma de los ratones espinosos puede arrojar luz sobre el mecanismo detrás de sus capacidades regenerativas. Si bien las FAP se han estudiado ampliamente en otros modelos animales, como en mus musculus14,15, actualmente no se han publicado protocolos para aislar las FAP de ratón espinoso. El desarrollo de un protocolo de este tipo llenaría un vacío significativo en el campo y permitiría a los investigadores examinar los mecanismos celulares y moleculares que subyacen al potencial regenerativo del ratón espinoso.
Este protocolo describe un protocolo robusto y reproducible para aislar, expandir y diferenciar las PAF del músculo esquelético y cardíaco del ratón espinoso. El protocolo descrito aquí produce suspensiones unicelulares de alta calidad que son adecuadas para la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Mediante el uso de rh-TGFβ1 o un medio compatible disponible comercialmente, dos métodos ampliamente utilizados para diferenciar las FAPs mus musculus 16, las FAPs espinosas clasificadas mantienen su capacidad de diferenciarse a lo largo del linaje fibrogénico y el linaje adipogénico, respectivamente (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Los tejidos espinosos de ratón son más sensibles a las tensiones en la disociación de los tejidos, y hay varios aspectos de este protocolo destinados a minimizar el estrés para mejorar la viabilidad celular. La técnica de disociación enzimática en serie se emplea para la preparación de muestras con el fin de reducir la concentración de la enzima requerida. A medida que avanza la digestión enzimática, la actividad enzimática disminuye. Al reemplazarlo con enzimas frescas, se p…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Andy Johnson y Justin Wong, núcleo de flujo de UBC, por su experiencia y ayuda en la optimización del protocolo FACS, así como al personal del centro de investigación biomédica de UBC para el cuidado de ratones espinosos. La Figura 1 se ha realizado utilizando Biorender. La Figura 2 se ha realizado utilizando el software FlowJo.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575–038 | |
| 1.7 mL Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| 20 mL syringe | BD | 309661 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 48 well flat-bottom tissue culture plate | Falcon | 53078 | |
| 5 mL polypropylene | Falcon | 352063 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| 5 mL syringe | BD | 309646 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
| 60 mm Petri dish | Falcon | 353002 | |
| 96 well V-bottom tissue culture plate | Corning | 3894 | |
| Acomys dimidiatus mice (spiny mice) | kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky). | ||
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-perilipin (1:100) | Sigma | P1873 | |
| Anti-SMA (1:100) | Invitrogen | 14-9760-82 | |
| APC PDGFRa (1:800) | Abcam | ab270085 | |
| BD PrecisionGlide Needle 18 G | BD | 305195 | |
| BD PrecisionGlide Needle 23 G | BD | 305145 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906-100g | |
| BV605 CD31 (1:500) | BD biosciences | 744359 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000) | Invitrogen | A31570 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000) | Invitrogen | A31573 | |
| Donkey serum | Sigma | S30-100ML | |
| FACS sorter – MoFlo Astrios 5 lasers | Beckman coulter | B52102 | |
| Fetal bovine serum | Gemini | 100-500 | |
| Fine scissors | FST | 14058-11 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Forceps | FST | 11051-10 | |
| Hemostat | FST | 91308-12 | |
| human FGF-basic recombinant protein (bFGF) | Gibco | 13256029 | |
| Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1) | eBiosciences | 14-8348-62 | |
| Incubator – Heracell 160i CO2 | ThermoFisher | 51033557 | |
| Inverted microscope – Revolve | ECHO | n/a | |
| Liberase | Roche | 5401127001 | |
| Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement | STEMCELL technologies | 5507 | |
| Mouse on mouse (MOM) blocking reagent | Vector Laboratories | MKB-2213 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648-500g | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140–122 | |
| PicoLab Mouse Diet 20 | LabDiet | 3005750-220 | |
| Propidium iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Transport vial 5mL tube | Caplugs Evergreen | 222-3005-080 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 |
Referencias
- Gaire, J., et al. Spiny mouse (Acomys): An emerging research organism for regenerative medicine with applications beyond the skin. NPJ Regen Med. 6, 1 (2021).
- Sandoval, A. G. W., Maden, M. Regeneration in the spiny mouse, Acomys, a new mammalian model. Curr. Opin. Genet. Dev. 64, 31-36 (2020).
- Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. A. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: Collaborators or saboteurs. FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
- Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. J Cell Sci. 124, 3654-3664 (2011).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 122 (12), 143-152 (2010).
- Soliman, H., et al. Pathogenic Potential of Hic1-Expressing Cardiac Stromal Progenitors. Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).
- Hall, C., Gehmlich, K., Denning, C., Pavlovic, D. Complex relationship between cardiac fibroblasts and cardiomyocytes in health and disease. J Am Heart Assoc. 10, 1-15 (2021).
- Gawriluk, T. R., et al. Comparative analysis of ear-hole closure identifies epimorphic regeneration as a discrete trait in mammals. Nat Commun. 71 (7), 1-16 (2016).
- Seifert, A. W. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys). Nature. 489, 561 (2012).
- Koopmans, T., et al. Ischemic tolerance and cardiac repair in the spiny mouse (Acomys). NPJ Regen Med. 6, 78 (2021).
- Peng, H., et al. Adult spiny mice (Acomys) exhibit endogenous cardiac recovery in response to myocardial infarction. NPJ Regen Med. 6, 74 (2021).
- Maden, M., et al. Perfect chronic skeletal muscle regeneration in adult spiny mice, Acomys cahirinus. Sci Rep. 8, 8920 (2018).
- Riparini, G., Simone, J. M., Sartorelli, V. FACS-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle. J Vis Exp. (184), e63983 (2022).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods Mol Biol. 1556, 179-189 (2017).
- Molina, T., Fabre, P., Dumont, N. A. Fibro-adipogenic progenitors in skeletal muscle homeostasis, regeneration and diseases. Open Biol. 11 (12), 210110 (2021).
- Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions. Skelet Muscle. 111 (11), 1-25 (2021).
- Fitzgerald, G., et al. MME+ fibro-adipogenic progenitors are the dominant adipogenic population during fatty infiltration in human skeletal muscle. Commun Biol. 61 (6), 1-21 (2023).
- Babaeijandaghi, F., et al. DPPIV+ fibro-adipogenic progenitors form the niche of adult skeletal muscle self-renewing resident macrophages. Nat Commun. 141 (14), 1-10 (2023).
- Schutz, P. W., Cheung, S., Yi, L., Rossi, F. M. V. Cellular activation patterns of CD10+ fibro-adipogenic progenitors across acquired disease states in human skeletal muscle biopsies. Free Neuropathol. 5, 3-3 (2024).
