长期小鼠脊髓器官型切片培养作为验证脊髓损伤细胞移植的平台

动物程序严格按照意大利公共卫生部和比萨大学当地伦理委员会批准的协议进行，符合指令2010/63/EU（项目许可证号39E1C）。N.5Q7 于 2021 年 10 月 30 日发布）。将C57BL / 6J小鼠置于调节环境（23±1°C，50±5%湿度）中，光暗循环12小时， 随意食物和水。 所有与h-SC-NES细胞相关的工作均根据美国国立卫生研究院（NIH）关于为生物医学研究目的获取和分配人体组织的指南进行，并得到每个获得样本的研究所的人类调查委员会和机构伦理委员会的批准。比萨大学生物伦理委员会已获得最终批准（第29/2020号审查）。去识别化的人类标本由 MRC/Wellcome Trust 联合赠款 （099175/Z/12/Z）、人类发育生物学资源 （www.hdbr.org） 提供。获得了适当的知情同意，并记录了每个标本的所有可用的非识别信息。组织是根据 NIH （http://bioethics.od.nih.gov/humantissue. html） 和 WMA 赫尔辛基宣言 （http://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/index.html） 制定的人类脑组织研究使用的伦理准则和规定进行处理的。 1. 脊髓（SC）分离和培养溶液和设备的制备 膜插件的涂层解决方案制备包衣溶液（表1）：含有0.1 mg mL-1胶原蛋白，0.01 mg mL-1聚-L-赖氨酸和0.01 mg mL-1层粘连蛋白的水溶液。 将每个膜插入物放入 35 mm 培养皿或 6 孔板中。 向膜顶部加入 1 mL 包被溶液：将溶液在室温 （RT） 下孵育 4 小时;然后，将其取出，让膜插入物干燥过夜 （ON）。将膜插入物储存在4°C直至使用。注意：所有传代均应在无菌条件下进行。使用前，膜包被应在4°C下保存最多1周，以避免蛋白质降解和切片与膜的粘附力欠佳。 培养基制备：器官型培养基、解剖培养基、移植培养基制备器官型培养基（OM， 表1）。 如 表1所述准备解剖培养基。 准备接枝培养基（GM，优化自Onoratí等人46， 表1）。注意：溶液应在无菌条件下制备，并在使用前（实验前 1 天或同一天）制备。 手术材料准备在生物安全柜中，请准备好以下物品以备使用：解剖立体显微镜和手术器械：两把微型剪刀、两把直镊子和两对弯曲的镊子。 在生物安全柜中，为切碎器仪器配备刀片，将SC切成薄片，以准备切碎器仪器。旋转斩波器的螺丝，将金属臂提起应放置刀片的位置。将刀片放置在指定位置，用刀片降低金属臂，直到它接触到切割台，然后用六角扳手拧紧固定螺钉，直到刀片牢固固定。将测微螺杆旋转到所需的切片厚度（通常为 350 μm）。检查刀片是否精确垂直于切割台放置。注意： 刀片相对于切割台精确垂直放置对于正确执行切割是必要的。 在生物安全柜中准备：两个塑料巴斯德移液器（需要移动分离的SC和切片），至少四个35毫米和两个60毫米的培养皿，以及一盒新鲜冰。 在使用前用70%乙醇和紫外线（一个20分钟的循环）对所有仪器进行灭菌，以保持培养无菌。 2. 小鼠SC的分离和切片的生成 小鼠SC的分离根据项目许可证处死出生后第 3 天 （P3） 小鼠幼崽。 通过使用微剪刀进行中线剖腹手术，将脊柱的腰部区域与小鼠身体的其余部分隔离开来，并将其放入35毫米培养皿中的冷解剖培养基中。 使用解剖立体显微镜和微型剪刀，沿矢状轴切开脊柱骨架，并使用直镊子轻轻从脊柱腔中取出脊柱侧突。 使用直镊子小心地从SC的孤立腰部区域剥离脑膜。 将分离的 SC 腰椎区域在冷和新鲜的解剖培养基中转移和孵育 10-15 分钟，然后再进行下一步。 切片的生成通过使用一个塑料巴斯德移液器，从解剖培养基中取出分离的SC腰部区域，并将其放置在斩波器仪器的切割台上，垂直于刀片。注意： SC 相对于刀片（垂直）的正确定位对于正确生成 SC 切片至关重要。 在巴斯德移液管和无菌吸收纸的帮助下，去除SC周围甲板上的残留解剖介质。继续进行 SC 自动切片。 生成切片后，将一些带有巴斯德移液管的新鲜解剖培养基与切片一起放在切割台上。然后，将切片收集到装有新鲜解剖培养基的 35 毫米培养皿中，并孵育 15 分钟。 在切片孵育期间，使用塑料巴斯德移液管用OM清洗膜插入物的表面3次。然后，在每个膜插入物的底部留下 1 mL OM。 在解剖体视显微镜下检查切片。通过用塑料巴斯德移液管转移它们，在调节的膜插入物上播种所需数量的切片。 在直镊子的帮助下，将切片按首选方向和所需位置移动到膜插入物上。用巴斯德移液管去除多余的培养基，使切片更好地粘附在膜表面。注意： 使用直镊子移动和定向切片应轻柔地进行，以避免组织或膜插入物损坏。 在37°C孵育30分钟后，将插入物转移到新的培养皿中。注意： 在更换培养基期间，请触摸塑料环，但不要触摸膜。 在膜插入物底部加入 1 mL 补充有神经胶质细胞系衍生神经营养因子 （GDNF） 100 ug mL-1 的新鲜 OM。 将切片在37°C孵育。 将培养中的第一天称为 离体 日 （DEV） 0。 3. 器官型切片的长期培养 将切片在37°C的培养物中保持至所需的时间点。 按照步骤 2.2.7-2.2.8 中所述，在 DEV 1 处用新鲜的 OM 替换培养基。 在 DEV 3 时，将培养基切换到 GM，以创造第二天移植干细胞的适当环境。每 48 小时用新鲜的 GM 替换培养基（例如，DEV 5、DEV 7…… 每天向培养基中加入新鲜的 GDNF（终浓度 100 μg mL-1），直至 DEV 7。在 DEV 7 之后，仅在介质更改时添加它（步骤 3.3）。 4. h-SC-NES细胞培养 注意：h-SC-NES细胞在生长因子（NES培养基，步骤4.1.1）存在下维持在培养物中。在移植之前，通过从培养基中去除生长因子（预分化培养基：不含成纤维细胞生长因子2（FGF-2）和表皮生长因子（EGF）的NES培养基，步骤4.1.2），将细胞置于预分化条件下7天。然后，在移植前将细胞置于分化条件（分化培养基，步骤4.1.3）中2天。通过在分化培养基中添加神经营养补充剂（脑源性神经营养因子，BDNF）来支持分化。h-SC-NES细胞12,46的维持、分裂、预分化和分化如下所述。 培养基制备：NES、预分化和分化培养基制备h-SC-NES细胞维持培养基（NES培养基， 表1）。 制备h-SC-NES细胞预分化培养基（预分化培养基， 表1）。 制备h-SC-NES细胞分化培养基（分化培养基， 表1）。当更换培养基或在分化条件下首次接种细胞时，新鲜添加 BDNF。注意：所有培养基应在无菌条件下制备，并应用0.22μm过滤器过滤。 h-SC-NES电池包被解决方案注意：h-SC-NES 细胞维持在 POLFN 包被的培养支持物中（POLFN = 聚-L-鸟氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白）。在试管中制备包衣溶液：含有层粘连蛋白（5μgmL – 1）和纤连蛋白（1μg mL – 1）的聚-L-鸟氨酸溶液。 将制备的包被溶液转移到细胞培养支持物中，注意添加足够的溶液以覆盖细胞培养支持物的整个表面。将涂层在37°C孵育1小时或在4°C下孵育过夜。 从细胞培养支持物中去除包被溶液。注意：POLFN 溶液可以再循环两次，但层粘连蛋白和纤连蛋白每次都应新鲜添加。 用细胞培养级无菌水清洗涂层 3 次。将涂层储存在4°C或使用它。注意：涂料应在 1 周内使用。之后，由于添加的蛋白质的降解过程，涂层被认为是过期的。 h-SC-NES电芯维护在NES培养基中维持h-SC-NES细胞的培养。每天在显微镜下检查细胞，以监测它们何时到达汇合处。 每 2 天更换一半的培养基：取出一半的调节培养基并加入新鲜的培养基（考虑 20% 蒸发率）。 如果细胞达到汇合点，则按照步骤 4.4 中所述进行分裂。 h-SC-NES细胞传代注意：单元格按以下方式拆分12：取出经过处理的培养基，用不含 Ca2+/Mg2+ 的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 洗涤细胞一次。 去除DPBS，向细胞中加入胰蛋白酶/EDTA溶液进行酶促分离。将细胞在37°C孵育30秒至1分钟。 孵育后，在显微镜下检查细胞：如果它们没有分离，轻轻敲击细胞培养支持以进行机械分离，并将它们在37°C下孵育30秒以上。 孵育后，通过向含有细胞和胰蛋白酶/EDTA 的细胞培养支持物中加入 4 体积的 DPBS/胎牛血清 （FBS）（10% 体积/体积）溶液来灭活胰蛋白酶/EDTA。轻轻地将溶液移液到细胞培养支持表面上下，以帮助所有细胞分离。将细胞悬液收集在试管中。 将细胞悬液以 200 × g 离心 3 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于新鲜的NES培养基中。 对细胞进行计数，并以 ̴0.5-1 × 105 个细胞/cm2 的密度将它们接种在每个新的 POLFN 包被的培养支持物上。 加入Y-27632（10μM）并将细胞置于37°C。 每天检查它们直到汇合，然后再次将它们分开进行维护/扩展或细胞库。 h-SC-NES细胞预分化按照步骤 4.4 中所述拆分单元格。 在预分化培养基中，将细胞以 ̴0.5-1 × 105 个细胞/cm2 的密度接种在 POLFN 包被的细胞培养物上。 分裂后加入Y-27632（10μM）。称体 外 预分化日（DIV）为0。 每 2-3 天更换一半的培养基（参见步骤 4.3.2）。 将细胞保持在预分化状态直到 DIV 7，然后继续进行步骤 4.6。 h-SC-NES细胞分化在预分化的 DIV 7 处，按照步骤 4.4 中所述分裂细胞。 在分化培养基中，将细胞以 ̴1-1.5 × 105个细胞/cm2的密度铺板在 POLFN 包被的细胞培养物上。 分裂后加入 Y-27632 （10 μM） 和 BDNF （30 ng mL-1）。 分化 2 天 （DIV 10） 后，将用于移植的细胞分成薄片。 5. h-SC-NES细胞转导与携带GFP的慢病毒载体 注：细胞转导在h-SC-NES细胞的维持阶段进行。当细胞正确转导时，这些细胞可以扩增并应用先前描述的预分化和分化方案（步骤 4.5 和 4.6）。 细胞转导培养基的制备注：细胞转导培养基是通过混合特定体积的NES培养基和精确体积的慢病毒载体储备液（LVS）制备物来制备的，根据不同的参数：所需的MOI（感染的多重性=病毒颗粒的数量与给定感染培养基中宿主细胞的数量之比）;电镀细胞的数量;LVS制剂的初始浓度（=LVS PFU，斑块形成单位）;所用培养容器的表面积。根据选定的MOI，使用公式（1）和（2）计算要添加到NES培养基中的LVS制剂的正确体积。（N 个细胞到板/cm2） × cm2 的细胞培养支持物 × MOI = 所选 MOI 的 LVS PFU （1）LVS PFU：Tot 初始 LVS 体积 （μL） = MOI 的 LVS PFU：添加到培养基中的 LVS 体积 （μL）（2）注意： LVS PFU （LVS 的初始 PFU）和 总初始 LVS 体积 由制造商给出。 所选 MOI 的 LVS PFU 的计算方法如公式 （1） 所示。因此，我们可以获得必须 添加到所选 MOI 的 NES 培养基总体积 （基于细胞培养支持）中的 LVS 制剂体积，如公式 （2） 中所述。示例：根据以前的实验室经验，我们使用了 MOI 3（MOI 可能因使用的细胞系和病毒制备物而异）。如果所需的MOI为3，则待接种的细胞数为0.5 × 105/cm2，培养支持物为1孔-MW24（2cm2），假设初始LVS PFU/TU（噬菌斑形成单位/转导单位）为1 mL（1,000μL =初始LVS vol）中的25 ×10 6 PFU，计算如下：接种在 1 孔 MW24 （2 cm2） 中的细胞 = 0.5 × 105 个细胞 × 2 cm2 = 1 × 105 个细胞1 × 105 个细胞 × 3 （MOI） = 3 × 105 PFU = MOI 3 的 LVS PFU25 × 106 PFU：1,000 μL = 3 × 105 PFU：x μLx μL = 12 μL = 添加到培养基中的 LVS 体积因此，要在 1 孔 MW24 中使用 MOI 3 的 细胞转导培养基 转导细胞，将 12 μL 初始 LVS 制备物添加到为 1 孔 MW24 制备的 NES 培养基 （238 μL） 中。最终总体积为 250 μL。注：培养基通常在转导当天在无菌条件下新鲜制备。 h-SC-NES转导实验方案在 NES 培养基中，以 0.5 × 105/cm2 的密度在 POLFN 包被的 24 多孔板（或任何其他培养支持物）上低传代接种 h-SC-NES 细胞。 第二天，从铺板细胞的孔中收集经过调节的NES培养基。根据所选的培养支持物，向细胞中加入均匀覆盖接种表面所需的最低体积的新鲜细胞转导培养基（例如，250 μL/孔的 24 多孔板）。 然后，将h-SC-NES细胞在37°C下孵育6小时。 之后，将先前收集的条件培养基添加到细胞中（200μL/24多孔板的孔）并将细胞在37°C下孵育。 第二天，用DPBS洗涤h-SC-NES细胞一次，并进行总培养基更换（NES培养基）。 接下来的几天，在荧光显微镜下检查细胞以观察GFP表达。 扩增用于细胞库和移植的 h-SC-NES 细胞。 6. 细胞移植到SC切片和共培养 玻璃微针的制备使用拉拔器从硼硅酸盐玻璃毛细管中获得细针。按如下方式设置拉拔器： HEAT 990、PULL 350。注意：从一个毛细管中，可以获得两个细针。 移植的细胞制备按照步骤 4.4 中所述拆分单元格。注意：如果细胞不表达荧光报告基因，则用细胞示踪染料标记它们，以便在移植后和长期培养期间使用荧光显微镜监测它们。按照所选制造商的协议进行标签步骤。 对分裂后的细胞进行计数，并以 200 × g 离心 3 分钟。用新鲜培养基+ Y-27632（10μM）悬浮获得的沉淀，以获得所需的细胞浓度（通常在30,000-50,000个细胞μL-1之间的范围）。 将细胞悬液转移到 500 μL 或 1.5 mL 试管中，并将其置于冰上。细胞已准备好进行移植。 细胞移植到器官型切片中注意：使用空气显微注射器和玻璃微针将 h-SC-NES 细胞移植到小鼠 SC 器官型切片中。使用微量移液管和微量装载器吸头将 4 μL 细胞悬液加载玻璃微针。注意：避免在针头中形成气泡，因为它可能会妨碍显微注射过程。如果形成气泡，请用微量移液器将其清除。 将针头放在显微注射器的指定支撑中，并使用直镊子折断针尖。注意： 将玻璃针折断靠近尖端，以避免形成大孔。 在移植到切片中之前，设置显微注射参数。将 压力 设置为 10 psi。注意：压力值可以根据显微注射器和操作员的观察来改变：压力应足以显微注射细胞悬液，避免组织损伤。 在校准的载玻片上，用巴斯德移液管滴一滴矿物油，并将细胞悬浮液显微注射到液滴中。在油滴中获得的细胞悬浮球的直径与特定的显微注射体积相关。根据需要更改显微注射参数，以达到0.2mm的细胞悬浮球直径，用于注射4nL。 设置正确的体积后，将细胞悬液快速显微注射到切片中。在荧光体视显微镜下检查切片中是否存在细胞，以验证显微注射/移植是否成功。注意：细胞悬液有时可能会阻塞针头：在这种情况下，尝试通过修改注射参数来去除细胞悬液的堵塞物，或用新鲜的细胞悬液加载新的针头。 移植后，将切片置于37°C和5%CO2至所需时间点，并按照步骤2.2.7-2.2.8中所述每隔一天进行培养基更换。 7.免疫荧光染色 第1天从插入膜底部取出培养基，并用预热的 DPBS 洗涤切片 3 次。 用预热的 4% 甲醛 （FA） 固定切片：去除 DPBS，并在膜插入物底部加入 1.5 mL 4% FA 与切片一起。在室温下孵育 15 分钟后，在膜插入物的上表面再加入 1 mL 的 4% FA，并在室温下孵育 15 分钟。 总固定时间：室温下 30 分钟 去除4，用DPBS洗涤切片3 x 10分钟。 用手术刀将插入物的膜沿圆周方向切开，将带有切片的膜与插入物的塑料组件分开，然后进行免疫荧光步骤。注意：在此步骤之后，带有切片的膜漂浮在培养皿中的 DPBS 中。 在室温下用 1 mL/膜的 0.7% Triton 溶液在 DPBS 中透化 10 分钟。 除去透化溶液，将样品在4°C下与1mL /膜的0.5%Triton，10S在DPBS中组成的封闭溶液孵育4小时。 去除封闭溶液，将一抗加入切片中，以工作稀释度，例如，小鼠抗神经丝 （NFL） 抗体，1：500;兔子反NFL，1：500;兔抗RBFOX3（NeuN）抗体，1：400;兔抗活性caspase-3（aCASP3），1：400;小鼠抗人细胞核，（胡-努），1：400;兔反胡女，1：400;小鼠抗GFP，1：400（如表1报告）在1mL抗体溶液中，该溶液由0.5%Triton，1S在DPBS中组成。在4°C下孵育ON。 第2天用 1-2 mL DPBS 洗涤膜 3 x 10 分钟。 用二抗（例如，山羊抗小鼠 IgG （H+L） 二抗，Alexa Fluor 488,1：500;山羊抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 568,1：500;山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 647,1：500;山羊抗兔 IgG （H+L） 二抗，Alexa Fluor 647,1：500，如表 1 所示）和 Hoechst/DAPI 在 1 mL/膜抗体溶液中稀释细胞核（Triton 0.5% + FBS 1% 在 DPBS 中）在室温下稀释 3 小时。注意：小心保护样品免受光线照射，以避免在孵育过程中和以下步骤中出现二抗漂白。 取出抗体溶液并用 DPBS （1-2 mL） 洗涤 3 x 10 分钟。 用新的DPBS替换DPBS，并在4°C的避光条件下储存。 在免疫荧光方案结束时，将膜安装在载玻片上。将一滴 200 μL 封固液放在载玻片上。在直镊子的帮助下，将浮动膜从 35 毫米培养皿转移到盖玻片上，然后将膜与安装溶液一起转移到载玻片上。 将一滴 100 μL 封固溶液滴在新的盖玻片上，并用它覆盖膜，将其固定在载玻片上。让它在化学罩下、避光条件下干燥过夜。 将样品储存在4°C的黑暗中或进行成像分析。 8. 活/死检测 通过每培养皿新鲜培养基分装 700 μL 来制备工作溶液，并在正确的工作稀释度下加入 Sytox（例如，组分 B，1：2,000）和钙黄绿素 AM（例如，组分 A，1：2,000）。注意：由于试剂对光敏感，因此请保护工作溶液免受光照照。 评估膜底部的培养基体积，并以步骤8.1中描述的相同工作稀释度加入Sytox和Cal黄绿素AM。 在步骤 8.1 中制备的每片工作溶液的顶部加入 2 滴 30 μL，每滴 30 μL。注意： 将培养皿置于黑暗环境中，以保护培养皿免受光线照射。 在室温下孵育切片 30 分钟。 孵育后，用手术刀从插入物上切出膜：之后，带有切片的膜漂浮在工作溶液中。 借助直镊子将没有安装溶液的膜倒置在盖玻片上，然后在膜顶部加入 100 μL DPBS 以保持它们水分。 使用共聚焦显微镜尽快获取实时图像。注意：在图像采集过程中，每 30 分钟在膜顶部添加 2 滴 40 μL DPBS，以防止膜变干。 9. 影像学检查 固定样品的共聚焦成像对于定性分析，使用具有以下采集参数的共聚焦显微镜采集图像：设置 大图像选项 （选择： 4 x 4），使用 10 x 物镜， 无堆栈， 分辨率 为 3,634 x 3,634 像素。 对于定量分析（aCASP3，钙黄绿素和Sytox用于切片，aCASP3用于细胞），使用具有以下采集参数的共聚焦显微镜采集图像： 20 x物镜，分辨率 为 1,024 x 1,024像素 ， Z步长 为 3μm。 使用体视显微镜对移植切片进行实时成像注意： 使用立体显微镜在明场和落射荧光模式下捕获图像。使用 明场 设置，采集切片的图像（1 x 物镜 ，此处使用 3 倍变焦 ）。注意：根据所使用的显微镜修改光线，并在必要时使用光纤。 使用 荧光 设置，使用与切片相同的物镜和缩放获取移植细胞的图像（参见步骤9.2.1）。使用以下参数进行采集： 增益 1，曝光 200-500 毫秒，偏移 -10。 使用共聚焦显微镜进行活/死测定后的实时成像使用具有以下采集参数的共聚焦显微镜采集图像： 20倍物镜，分辨率1,024 x 1,024像素 ， Z步长 为 3μm。 10. 通过ImageJ进行图像分析 NFL、RBFOX3 和 DAPI 面积分析打开 ImageJ 软件 （https://imagej.net/software/imagej/）。 通过单击 “文件”|“打开”|选择“文件”|“打开”来打开文件图像。 在弹出的窗口中，选择堆栈查看 |Hyperstack 和颜色模式 |默认值（具有自动缩放功能）。 在工具栏中，选择 “图像”|”颜色 |拆分频道。 选择要分析的所需通道：NFL 的绿色通道（轴突标记物）、RBFOX 3 的红色通道（神经元标记物）和 DAPI（核染色）的蓝色通道。 对于 NFL 分析，请继续执行以下步骤：在工具栏中选择图像 |调整 |阈值 | 选择 参数 （深色背景、算法，例如默认值）并在值条上移动光标（下方/上方）以覆盖和外界所有神经突区域（神经突在深色背景中以白色高亮显示） | 套装 |申请。 从工具栏中选择 描摹工具 Wand 并使用它来自动定义 NFL 覆盖的白色区域。新闻 分析 |测量 |面积值，单位为μm 2。 对于 DAPI 和 RBFOX3 分析，请继续执行以下步骤：在工具栏中，选择“图像”|”调整 |阈值 |选择参数（白色背景、算法，例如默认值）并在值条上移动光标（下方/上方）以覆盖和限制所有 RBFOX3 或 DAPI 区域 |套装 |申请。 在工具栏中，选择“ 处理”|”傅里叶变换 |带通滤光片。 使用 阈值条 调整 RBFOX3 或 DAPI 覆盖的白色区域，对应于它们的荧光信号。 从工具栏中，选择 描摹工具 Wand 并使用它来自动定义 RBFOX3 或 DAPI 覆盖的区域。新闻 分析 |测量 |面积值，单位为μm 2。 通过ImageJ分析细胞凋亡打开 ImageJ 软件 （https://imagej.net/software/imagej/）。 单击 “文件”|“打开”|选择“文件”|“打开”，打开 Z-stack 文件图像。 在弹出的窗口中，选择堆栈查看 |Hyperstack 和颜色模式 |默认值（具有自动缩放功能）。 在工具栏中，选择 “图像”|”颜色 |拆分频道。 选择所需的通道：红色通道用于 aCASP3（要分析的细胞凋亡标记物），蓝色或青色通道用于 DAPI 或 胡-Nu 用于细胞核。然后，通过在工具栏中选择“图像”|”颜色 |合并频道 |创建复合。 拖动图像底部的 Z 条以浏览图像的 Z 堆栈，并识别切片中心区域中具有 aCASP3 阳性的堆栈。 在工具栏中，选择 Plugins |分析 |细胞计数器。 在打开的弹窗中，选择 “初始化” ，为计数准备镜像;然后，选择 计数器类型 （例如，Type 1） 并将其重命名为要计数的对象（例如，aCASP3+ 细胞）。如上所述重命名其他计数器类型以对其他对象进行计数（例如，DAPI+ 或 胡-Nu+ 单元格表示单元格总数）。 在弹出的窗口中，选择与要计数的对象对应的计数器类型（例如，aCASP3+ 细胞），然后选择工具栏中的 点工具 ，并开始手动计算凋亡细胞的数量，aCASP3 为阳性，单击打开的图像中的每个阳性细胞。 在细胞计数器窗口中选择另一种计数器类型，并开始计算细胞总数（DAPI+ 细胞，用于切片;胡-Nu+ 细胞，用于移植细胞）。 通过 ImageJ 分析活/死检测打开 ImageJ 软件 （https://imagej.net/software/imagej/）。 单击 “文件”|“打开”|“选择文件”|“打开”来打开 Z-stack 文件图像。 在弹出的窗口中，选择堆栈查看 |Hyperstack 和颜色模式 |默认值（具有自动缩放功能）。 在工具栏中，选择“ 图像”|”颜色 |拆分频道。 选择所需的通道：钙黄绿素（要分析的活力标记物）的绿色通道和 Sytox（死亡标记物）的青色通道。然后，通过在工具栏中选择“图像”|”颜色 |合并频道 |选择“创建复合”。 拖动图像底部的 Z 条以浏览图像的 Z 堆栈，并识别切片中心区域中具有钙黄绿素和 Sytox 阳性的堆栈。 在工具栏中，选择 Plugins |分析 |细胞计数器。 在打开的弹窗中，选择 “初始化” ，为计数准备镜像;然后选择 计数器类型 （例如，Type 1） 并将其重命名为要计数的对象（例如，Calcein+ 细胞）。如果需要对另一个对象（例如，Sytox + 细胞）进行计数，请重命名上述其他计数器类型。 在弹出的窗口中，选择要计数的对象对应的计数器类型;然后选择工具栏中的 “点”工具 ，并开始手动计算Cal黄绿素+ 单元格的数量，单击打开的图像中的每个阳性单元格。 在细胞计数器窗口中选择另一种计数器类型，并按照钙黄绿素的说明对 Sytox+ 细胞进行计数。 11. 图表和统计分析 使用所选软件执行所有统计分析并绘制图表。