Aquí, presentamos la preparación paso a paso de la amplificación isotérmica premezclada basada en recombinasa liofilizada y reacciones basadas en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR), que se pueden utilizar para la detección de biomarcadores de ácidos nucleicos de patógenos de enfermedades infecciosas u otros marcadores genéticos de interés.
El diagnóstico molecular mediante la detección basada en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR) tiene una alta precisión diagnóstica y atributos adecuados para su uso en entornos de punto de atención, como tiempos de respuesta rápidos para los resultados, lecturas simples y convenientes y sin necesidad de instrumentos complicados. Sin embargo, las reacciones pueden ser engorrosas de realizar en el punto de atención debido a sus numerosos componentes y pasos de manipulación manual. En este artículo, proporcionamos un protocolo optimizado paso a paso para la detección robusta de patógenos de enfermedades y marcadores genéticos con amplificación isotérmica basada en recombinasa y reactivos basados en CRISPR, que se premezclan y luego se liofilizan en formatos fáciles de almacenar y listos para usar. Los reactivos premezclados liofilizados se pueden rehidratar para su uso inmediato y conservan una alta eficiencia de amplificación y detección. También proporcionamos una guía de solución de problemas comunes al preparar y usar reactivos premezclados y liofilizados para diagnósticos basados en CRISPR, para que la plataforma de detección sea más accesible para las comunidades más amplias de pruebas genéticas y de diagnóstico.
Los diagnósticos basados en CRISPR para la detección de biomarcadores de ácidos nucleicos se informaron por primera vez en 2017 1,2,3,4 y, desde entonces, se han demostrado como diagnósticos de próxima generación con pruebas aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA), particularmente para la detección del ARN del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo 2 (SARS-CoV-2), en varios países 5,6,7,8. Más allá de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), se ha demostrado que las tecnologías son efectivas para detectar diversos virus y bacterias 9,10,11,12,13, mutaciones y deleciones de enfermedades genéticas, y pueden diseñarse para detectar biomarcadores de proteínas y moléculas pequeñas 2,12. Los diagnósticos basados en CRISPR a menudo combinan métodos de amplificación isotérmica, como la amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) o la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP)14,15, con la detección basada en CRISPR utilizando enzimas asociadas a CRISPR (Cas) guiadas por ARN con actividad endonucleasa “colateral” después del reconocimiento de objetivos3. El doble uso de la amplificación isotérmica y la detección basada en CRISPR confiere varios atributos deseables a las tecnologías, en particular una alta precisión diagnóstica cercana a la de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de referencia, y la capacidad de multiplexar y detectar pequeñas diferencias de secuencia, incluidos los polimorfismos de un solo nucleótido 1,9.
Sin embargo, las versiones más precisas de los diagnósticos basados en CRISPR contienen múltiples componentes y pasos, y pueden ser complicadas de realizar con personas no expertas o en el punto de atención (POC). Para abordar este desafío de extender el uso de diagnósticos basados en CRISPR de alta precisión a entornos POC, hemos desarrollado protocolos para preparar reacciones de detección basadas en CRISPR y amplificación isotérmica premezcladas, liofilizadas, basadas en recombinasa y CRISPR, que son fáciles de usar y almacenar7. Estos protocolos deben complementar los excelentes protocolos existentes sobre diagnósticos basados en CRISPR14, que contienen información adicional sobre la producción de componentes bioquímicos necesarios para el diagnóstico basado en CRISPR7, las directrices de diseño1 y las formulaciones que utilizan técnicas alternativas de amplificación isotérmica 2,14,15,16 y enzimas Cas12. En última instancia, esperamos que los diagnósticos basados en CRISPR puedan ayudar a realizar una detección nucleica rápida, económica y sensible en entornos donde se requieren análisis portátiles y sin instrumentos 1,9,17.
Utilizamos principalmente la combinación de RPA y detección basada en Cas13 en nuestros protocolos. RPA funciona a temperaturas cercanas a la temperatura ambiente (37-42 °C) y, por lo tanto, tiene bajos requisitos de energía y equipo. Otras reacciones de amplificación isotérmica requieren temperaturas más altas (LAMP, 60-65 °C; amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), 60 °C; reacción de amplificación exponencial (EXPAR), 55 °C; y amplificación dependiente de helicasa (HDA), 65 °C)2. El diseño de los cebadores RPA tampoco es complejo, a diferencia de los cebadores LAMP, y puede extenderse a la amplificación multiplexada 7,9,14. A pesar de que la multiplexación más allá de dos objetivos con RPA es difícil en la práctica, existen directrices claras sobre cómo diseñar cebadores de RPA multiplexados para minimizar la interferencia18.
Si bien la contaminación de arrastre sigue siendo un gran problema en el flujo de trabajo de dos pasos, los amplicones generados de RPA son de tamaño pequeño y es menos probable que causen contaminación de arrastre en comparación con los amplicones concateméricos grandes de LAMP14. Los cebadores RPA se pueden diseñar de acuerdo con las pautas estándar14: generalmente tienen una longitud de 25-35 nucleótidos con temperaturas de fusión de 54 a 67 °C. El tamaño del amplicón debe ser inferior a 200 pares de bases. La enzima de transcriptasa inversa (RT) se puede agregar a RPA para permitir la amplificación a partir de ARN, y en la transcripción inversa-RPA (RT-RPA), otra enzima, la ribonucleasa H (RNasa H), generalmente se agrega en pequeñas cantidades para ayudar a resolver el híbrido de ARN: ADN resultante y promover la reacción de amplificación 5,19. Para permitir la transcripción de T7 para la detección basada en Cas13, el promotor de la ARN polimerasa T7 se puede colocar en el extremo 5′ del cebador RPA directo.
Una vez que se generan amplicones a partir de RPA, se pueden detectar con enzimas Cas programadas con crRNA. Entre las diversas enzimas Cas que se pueden utilizar para la detección de amplicones, preferimos las variantes de Cas13 dirigidas al ARN debido a su alta actividad de escisión1 y a sus preferencias de escisión de polinucleótidos bien caracterizadas 7,9, la última de las cuales puede utilizarse para la detección multiplexada. La secuencia de crRNA para Cas13 está diseñada para ser complementaria (complemento inverso) al sitio diana en el ARN producido con secuencias espaciadoras y de repetición directa (DR). La secuencia de crRNA y los cebadores de RPA no deben superponerse, para evitar la detección no deseada basada en Cas de productos de amplificación fuera del objetivo, lo que aumenta los falsos positivos y de fondo14.
La detección basada en Cas se basa en diferentes modalidades de detección para monitorear la escisión de las moléculas de ácido nucleico indicador (reporteros de ARN para reacciones basadas en Cas13)1,2,14. Las diferentes modalidades de detección incluyen colorimetría, lecturas electroquímicas, fluorescencia, lecturas de secuenciación y tiras de flujo lateral2. Nos centramos en la lectura de fluorescencia dada una variedad de fluoróforos y reporteros como la cianina 5 (Cy5), la rodamina X (ROX) y la carboxifluoresceína (FAM), que pueden excitarse eficazmente utilizando una sola fuente de luz LED azul, y su fluorescencia analizada por un lector de microplacas o un termociclador en tiempo real 7,14. Además, la lectura de fluorescencia es fácil de configurar y permite un monitoreo continuo, lo que permite la cuantificación en tiempo real. La preamplificación multiplexada de RPA y la detección multiplexada basada en Cas13 utilizando enzimas Cas pueden combinarse con lecturas de fluorescencia multicolor para la detección simultánea de múltiples objetivos genéticos 2,7.
En nuestros protocolos, primero amplificamos isotérmicamente el ARN con RT-RPA añadiendo la muestra de ARN a la forma liofilizada del reactivo RT-RPA (Figura 1). Durante la RT-RPA, el promotor T7 se añade al amplicón de ADN bicatenario generado. A partir de entonces, los productos de RPA se transfieren a la detección basada en Cas13 liofilizada, que también contiene ARN polimerasa T7. Esta reacción de detección convertirá los amplicones de ADN en ARN (a través de la ARN polimerasa T7), que se puede detectar fácilmente con Cas13 programado con crRNA. El Cas13 activado por el objetivo escindirá las moléculas reporteras para producir una señal de fluorescencia detectable 2,7,14. Si bien los protocolos aquí se refieren a la detección por Leptotrichia wadei (LwaCas13a), pueden extenderse a la detección simultánea y multiplexada de hasta cuatro objetivos utilizando enzimas ortogonales Cas13 y Cas12 7,9. Las reacciones de detección basadas en RPA y Cas también pueden combinarse en un solo tubo, aunque con una pérdida de sensibilidad14.
Figura 1: Flujo de trabajo de detección basado en CRISPR. El flujo de trabajo ilustra la detección de dos genes diana. En primer lugar, las regiones de interés dentro del objetivo de ADN se amplifican isotérmicamente con RPA; la reacción se puede realizar con transcripción inversa (RT-RPA) al detectar dianas de ARN. A partir de entonces, la transcripción de T7 convierte los amplicones de dsDNA en ARN, que a su vez son reconocidos por complejos Cas13-crRNA capaces de provocar actividad de ARNasa colateral tras la unión al objetivo. La escisión de los reporteros de fluorescencia apagados produce señales de fluorescencia que se pueden monitorear con un lector de microplacas, visualizar mediante un transiluminador LED o usar con un termociclador en tiempo real. Abreviaturas: CRISPR = repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas; RT = transcripción inversa; RPA = amplificación de la polimerasa recombinasa; Cas = proteína asociada a CRISPR; LED = diodo emisor de luz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las características clave de los protocolos presentados aquí son las formulaciones de premezcla para la liofilización. La premezcla simplifica el uso de la reacción y mejora la reproducibilidad, pero muchos componentes dentro de la detección basada en RPA y Cas, particularmente la transcripción inversa y algunos cofactores lábiles como el ATP, no son estables en la solución. Por lo tanto, formulamos las soluciones premezcladas de manera que puedan liofilizarse para su almacenamiento a largo plazo y facilitar su transporte e implementación 1,9,20. Los reactivos premezclados liofilizados también ayudan a mejorar la sensibilidad de detección, ya que se puede añadir un mayor volumen de muestra (y, por tanto, una mayor entrada de ADN/ARN) para reconstituir la reacción10. En nuestras formulaciones, utilizamos principalmente trehalosa21 como crioprotector en reacciones de detección basadas en RPA liofilizado y Cas7. Además de la conservación de reactivos, la trehalosa también promueve las reacciones a través del aumento de la estabilización de la enzima 16,22,23,24 y la disminución de las temperaturas de fusión del dsDNA23. Las exploraciones de otros estabilizadores 5,7,21,25,26 más allá de la trehalosa pueden producir formulaciones aún más óptimas para diferentes escenarios de uso.
Hay pasos críticos en este protocolo. Para la segregación de área, se recomienda utilizar espacios separados para la extracción de ácidos nucleicos, la preparación de la mezcla maestra (área de preamplificación), la adición de muestras y la detección de amplicones (área de posamplificación). Cada área debe establecerse mediante el uso de un conjunto separado de herramientas y equipos. No lleve herramientas de un área a otra, especialmente desde el área de postamplificació…
The authors have nothing to disclose.
C.U. agradece la financiación del Siam Commercial Bank en el marco del VISTEC-Siriraj Frontier Research Center, y del Fondo Fundamental de Investigación e Innovación Científica de Tailandia (TSRI), año fiscal 2024, número de subvención FRB670026/0457. R.K. y M.P. cuentan con el apoyo de los fondos de becas y ayudantías de investigación de VISTEC, respectivamente.
Material | |||
Betaine solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
DEPC-Treated water | Invitrogen | AM9915G | |
Dithiothreitol (DTT) | Merck | 3870-25GM | |
EpiScript reverse transcriptase | Lucigen | ERT12925K | |
Gly-Gly-Gly | Sigma-Aldrich | SIA-50239-1G | |
LwaCas13a | Producing in-house | Strain name:Leptotrichia wadei, Abbreviation: Lwa, Protein name: LwaCas13a | |
Magnesium chloride solution, 1M | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
NxGenT7 RNA polymerase | Lucigen | 30223-2 | |
Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
Potassium acetate solution, 5M | Sigma-Aldrich | 95843-100ML-F | |
Riobnucleotide Solution Mix | NEB | N0466L | |
RNase H | NEB | M0297L | |
Sucrose | TCI | TCI-S0111-500G | |
Trehalose Dihydrate | Sigma-Aldrich | SIA-90210-50G | |
Trizma hydrochloride solution, 1M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194-100ML | |
TwistAmp Basic kit | TwistDx | TABAS03KIT | |
Equipment | |||
BluPAD Dual LED Blue/White light transilluminator | Bio-Helix | BP001CU | |
Dry Bath Dual Block | ELITE | 4-2-EL-02-220 | Model: EL-02 |
Fluorescence microplate reader | Tecan | 30050303 | Model: Infinite 200 Pro |
Freeze dryer | LABCONCO | 794001030 | FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer |
Microplate 384-well | Greiner | GDE0784076 | F-Bottom, small volume, Hibase, Med. Binding, Black |
Real-time thermal cycler (CFX Connect Real-Time PCR System) | Bio-Rad | 185-5201 | Model: CFX Connect Optics Module |
Oligonucleotide | |||
s-gene forward RPA primer | IDT | GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA |
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s-gene reverse RPA primer | IDT | TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG |
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n-gene forward RPA primer | IDT | GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG |
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n-gene reverse RPA primer | IDT | CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC |
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LwaCas13a-crRNA for the s gene | Synthego | GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG |
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LwaCas13a-crRNA for the n gene | Synthego | GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC |
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FAM-polyU-IABkFQ reporter | IDT | 56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ | |
O-hannah_cytb_F RPA primer | IDT | GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG |
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O-hannah_cytb_R RPA primer | IDT | AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA |
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synT7crRNA13a_ O_hannah | IDT | GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC |