Summary

Exploración de soluciones alternativas de perfusión utilizando portadores de oxígeno basados en hemoglobina polimerizada de próxima generación en un modelo de perfusión pulmonar ex vivo en ratas

Published: June 14, 2024
doi:

Summary

Aquí, describimos la aplicación de un portador de oxígeno basado en hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb) como perfusión y el protocolo en el que esta solución de perfusión se puede probar en un modelo de perfusión pulmonar ex vivo en ratas.

Abstract

El trasplante de pulmón se ve obstaculizado por la falta de donantes adecuados. Anteriormente, se descartaban los donantes que se consideraban marginales o inadecuados. Sin embargo, una tecnología nueva y emocionante, como la perfusión pulmonar ex vivo (EVLP), ofrece a los proveedores de trasplantes de pulmón una evaluación ampliada para los aloinjertos de donantes marginales. Esta plataforma de evaluación dinámica ha provocado un aumento del trasplante pulmonar y ha permitido a los proveedores utilizar donantes que antes se descartaban, ampliando así el grupo de donantes. Las técnicas de perfusión actuales utilizan perfusionados celulares o acelulares, y ambos tienen ventajas y desventajas distintas. La composición de la perfusión es fundamental para mantener un entorno homeostático, proporcionar un apoyo metabólico adecuado, disminuir la inflamación y la muerte celular y, en última instancia, mejorar la función de los órganos. Las soluciones de perfusión deben contener una concentración de proteínas suficiente para mantener una presión oncótica adecuada. Sin embargo, las soluciones de perfusión actuales a menudo conducen a la extravasación de líquido a través del endotelio pulmonar, lo que resulta en edema y daño pulmonar inadvertido. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevas soluciones de perfusión que eviten el daño excesivo mientras mantienen una homeostasis celular adecuada. Aquí, describimos la aplicación de un portador de oxígeno basado en hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb) como perfusión y el protocolo en el que esta solución de perfusión se puede probar en un modelo de EVLP de rata. El objetivo de este estudio es proporcionar a la comunidad de trasplantes pulmonares información clave para el diseño y desarrollo de nuevas soluciones de perfusión, así como los protocolos adecuados para probarlas en modelos de trasplante traslacional clínicamente relevantes.

Introduction

Como cualquier campo en el trasplante de órganos sólidos, el trasplante de pulmón sufre de una escasez de órganos de donantes. Con el fin de aumentar el grupo de donantes, se han dedicado importantes investigaciones a investigar el potencial de los aloinjertos que antes se pensaba que no eran adecuados para el trasplante, es decir, los donantes de criterio extendido (ECD). Estos aloinjertos pueden considerarse ECD por una serie de razones, que incluyen calidad cuestionable, mala función, infección, traumatismo, tiempos isquémicos cálidos o fríos prolongados y edad avanzada 1,2. En ciertos casos, en los que estos pulmones son adecuados para el trasplante inmediato3, a menudo es ventajoso tanto para los proveedores como para los receptores evaluar estos pulmones durante un tiempo adicional para determinar su idoneidad para el trasplante. La perfusión pulmonar ex vivo (EVLP) es una tecnología que permite una evaluación ampliada de posibles aloinjertos pulmonares en un circuito cerrado fuera del donante 2,4,5,6,7, lo que permite al proveedor del trasplante determinar la idoneidad del trasplante. La EVLP ha demostrado la capacidad de evaluar adecuadamente los órganos del donante 8,9,10,11, disminuir los efectos de la lesión por reperfusión isquémica (IRI)12,13 y aumentar el número de donantes14,15, lo que hace que el trasplante pulmonar sea un tratamiento más accesible para todos.

En general, un sistema EVLP es un sistema cerrado con un circuito ventilatorio (que se logra conectando un ventilador a la tráquea para introducir aire en el sistema) y un circuito vascular (que se logra conectando la aurícula izquierda (AI) a la arteria pulmonar (AP) con tubos)7. El circuito vascular tiene perfusión que corre a través del tubo para proporcionar al pulmón nutrientes vitales y oxígeno, al tiempo que limita el tiempo de isquemia fría (TCE)5,8,16,17. Esta solución es de base sanguínea (es decir, a través de la adición de glóbulos rojos empaquetados (PRBC))16,17 o de base acelular (es decir, sin PRBC)4,5. Sin embargo, existen varias desventajas notables en el uso de PRBC. Si se utilizan PRBC de donantes que murieron por traumatismo o donantes con muerte cerebral (BDD), estos fluidos a menudo contienen grandes cantidades de citocinas inflamatorias, lo que puede aumentar el daño celular durante la EVLP, así como aumentar los niveles de hemoglobina libre de células (Hb), hemo, hierro y fragmentos celulares que causan daño adicional a las células18,19. Además, dado que estos donantes suelen ser multiorgánicos, la recolección de PRBC antes de la obtención podría conducir a una disminución del volumen sanguíneo en el donante y, posteriormente, a un aumento de la isquemia en todos los órganos. Si se utilizan PRBC de otra fuente, los proveedores podrían enfrentar escasez de sangre, ya que este es un material escaso en sí mismo20,21. Por último, los PRBC son propensos a la lisis mecánica en el circuito EVLP, independientemente de su fuente, liberando Hb y otros componentes que contribuyen al daño celular.

Por lo tanto, por muchas razones, podría ser ventajoso utilizar un sustituto artificial de glóbulos rojos, es decir, portadores de oxígeno basados en hemoglobina (HBOC), como suplemento de perfusión. Un HBOC particularmente prometedor es la hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb). La poliHHb se sintetiza a partir de Hb purificada a partir de PRBC caducados que se consideraron inadecuados para la transfusión inmediata22. Se ha demostrado que son sustitutos viables de la sangre en el shock hemorrágico23 y en el trasplante24 y pueden producirse en grandes cantidades22. Sin embargo, la adopción a gran escala de PolyhHb no ha tenido éxito debido a complicaciones imprevistas como vasoconstricción, aumento de la presión arterial y paro cardíaco23,25. Las razones detrás de estos hallazgos probablemente se debieron a la presencia de Hb libre de células o polímeros de Hb de bajo peso molecular (< 500 kDa) en la solución de PolyhHb, ya que tienen una propensión a extravasarse al espacio tisular, lo que resultó en una disminución de la disponibilidad de óxido nítrico, vasoconstricción posterior, hipertensión sistémica y, finalmente, lesión oxidativa del tejido26,27. Para mejorar estos problemas, el Laboratorio Palmer ha trabajado en el desarrollo de una nueva generación de PolyhHb que contiene un mínimo de especies de bajo MW y Hb libre de células, que ha demostrado mejores características biofísicas y respuestas in vivo 22,28,29,30. Varios estudios de transfusión en animales han demostrado que si se eliminan los polímeros de Hb de bajo peso molecular del HBOC, se pueden mitigar la vasoconstricción, la hipertensión sistémica y el daño oxidativo 28,29,31,32,33,34,35. Por lo tanto, esto convierte a este PolyhHb de próxima generación en un candidato prometedor para perfundir.

Aquí, describimos la aplicación de un PolyhHb de próxima generación para ser utilizado en una perfusión y el protocolo por el cual esta solución de perfusión puede ser probada en un modelo de EVLP de rata. El objetivo de este estudio es proporcionar a la comunidad de trasplantes pulmonares información clave para el diseño y desarrollo de nuevas soluciones de perfusión, así como proporcionar protocolos para probarlas en modelos de trasplante traslacional clínicamente relevantes.

Protocol

Las ratas Sprague-Dawley (300 g de peso corporal) se obtuvieron comercialmente y se alojaron en condiciones libres de patógenos en el Centro Médico Wexner de la Universidad Estatal de Ohio. Todos los procedimientos se realizaron de manera humanitaria de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso Humanitario de Animales de Laboratorio de los NIH y el Consejo Nacional de Investigación y con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal d…

Representative Results

En la Figura 10 se demuestra la validación de nuestra perfusión basada en PolyhHb y, además, la estabilidad de esta perfusión durante varias horas. Durante la primera 1 h, todas las perfusionadas probadas (PolyhHb, Control (Williams Media + 5% HSA), basadas en RBC) mostraron una ligera disminución de LA pO2 (Post pO2). Sin embargo, la perfusión basada en glóbulos rojos mostró una disminución significativa a 1 h en comparación …

Discussion

El desarrollo y las pruebas de soluciones de perfusión es un esfuerzo novedoso en el que se están embarcando muchas personas en todo el mundo. Tradicionalmente, las perfusiones estándar ofrecen la capacidad de suspender el tiempo isquémico y mitigar las lesiones asociadas a la isquemia, así como la reperfusión18. Sin embargo, la próxima evolución de la EVLP es mejorar la tecnología actual de perfusión, así como incorporar terapias de reparación y reaco…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación fue generosamente apoyada por el Jewel and Frank Benson Family Endowment y la Cátedra de Investigación Jewel and Frank Benson. B.A.W. cuenta con el apoyo parcial de la subvención de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) R01HL143000. A.F.P. cuenta con el apoyo de las subvenciones de los NIH R01HL126945, R01EB021926, R01HL131720 y R01HL138116 y de la W81XWH1810059 de subvenciones del Comando de Investigación Médica y Material del Ejército de los EE. UU. S.M.B. cuenta con el apoyo de la DK123475 NIH R01.

Materials

10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needle B-D 309301
30 L Glass Batch Bioreactor Ace Glass
30g Needle Med Needles BD-305106
Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets Elanco NA
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) Sigma Aldrich 10035-04-8 For modified Ringer's lactate
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 Harvard Apparatus 731747
Connect kit D150 Cole-Parmer  VK 73-3763
Dumont #5 Forceps Fine Science tools 11252-50
Dumont Medical #5/45 Forceps – Angled 45° Fine Science tools 11253-25
Ecoline Star Edition 003, E100 Water Heater Lauda LCK 1879
Expired human leukoreduced, packed RBC units Wexner Medical Center
Canadian Blood Services
Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150 Hugo Sachs Elektronik PY2 73-3762
Forceps Fine Science tools 11027-12
Glutaraldehyde (C5H8O2 70 wt%) Sigma Aldrich 111-30-8 (G7776)
Halsted-Mosquito Hemostat Roboz Surgical RS-7112
Heparin 30,000 units per 30 ml APP Pharmaceuticals
Human Serum Albumin (HSA) OctaPharma Plasma Perfusate additive
IL2 Tube set for perfusate Harvard Apparatus 733842
IPL-2 Basic Lung Perfusion System Harvard Apparatus
Ketamine 500 mg per 5 ml JHP Pharmaceuticals
Left Atrium cannula Harvard Apparatus 730712
Liqui-Cel EXF Series G420 Membrane Contactor 3M G420 gas contactor
low potassium dextran glucose solution (perfadex) XVIVO solution flushing the lung
Masterflex Platinum Coated Tubing(Size: 73,17,16,24) Cole-Palmer
N-Acetyl-L-cysteine (NALC, C5H9NO3S) Sigma Aldrich 616-91-1 (A7250) For modified Ringer's lactate
Nalgene Vessels (10L, 20L) Nalgene Filtration vessels
Peristaltic Pump  Ismatec  ISM 827B
PES, 0.65 µm TFF module Repligen N02-E65U-07-N
PhysioSuite Kent Scientific Corporation PS-MSTAT-RT
polyethersulfone (PES), 0.2 µm TFF module Repligen N02-S20U-05-N
Polysulfone (PS), 500 kDa TFF module Repligen N02-P500-05-N
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific 7447-40-7 For PBS
PowerLab 8/35  ADInstruments 730045
Pulmonary Artery cannula Harvard Apparatus 730710
Pump Head tubing (Size: 73,17,16,24) PharMed BPT
Puralube Ophthalmic Ointment Dechra NA
Scissors Fine Science tools 14090-11
SCP Servo controller for perfusion type 704 Harvard Apparatus 732806
Small Animal Ventilator model 683 Harvard Apparatus 55-000
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific 7647-14-5 (S271-10) For PBS and saline
Sodium cyanoborohydride (NaCNBH3) Sigma Aldrich 25895-60-7
Sodium Dithionite (Na2S2O4) Sigma Aldrich 7775-14-6
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher Scientific 1310-73-2 For modified Ringer's lactate
Sodium Lactate (NaC3H5O3) Sigma Aldrich 867-56-1 For modified Ringer's lactate
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Fisher Scientific 7558-79-4 For PBS
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Fisher Scientific 7558-80-7 For PBS
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System Kent Scientific Corporation SS-MVG-Module
Sprague-Dawley rats Envigo
TAM-A transducer amplifier module type 705/1 Harvard Apparatus 73-0065
TAM-D transducer amplifier type 705/2 Harvard Apparatus  73-1793
TCM time control module type 686 Harvard Apparatus 731750
Tracheal cannula Harvard Apparatus 733557
Tube set for moist chamber Harvard Apparatus  73V83157
Tubing Cassette Cole-Parmer IS 0649
Tweezer #5 Dumostar Kent Scientific Corporation  INS500085-A
Tweezer #5 stainless steel, curved Kent Scientific Corporation IND500232
Tweezer #7 Titanium Kent Scientific Corporation  INS600187
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm ID Harvard Apparatus 721017 perfusate line entering lung
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm ID Harvard Apparatus 721019 perfusate line leaving lung
Vannas-Tubingen Spring Scissors Fine Science Tools 15008-08
VCM ventilator control module type 681 Harvard Apparatus 731741
William's E Media Gibco, ThermoFisher Scientific A12176-01 Perfusate additive
Xylazine 100 mg per 1 ml Akorn

Referencias

  1. Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2021 annual data report: Lung. Am J Transplant. 23, S379-S442 (2023).
  2. Gouchoe, D. A., et al. Ex vivo lung perfusion in donation after circulatory death: A post hoc analysis of the normothermic Ex Vivo lung perfusion as an assessment of extended/marginal donors lungs trial. J Thorac Cardiovasc Surg. , (2024).
  3. Bobba, C. M., et al. Trends in donation after circulatory death in lung transplantation in the United States: Impact of era. Transpl Int. 35, 10172 (2022).
  4. Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. Lancet. 357 (9259), 825-829 (2001).
  5. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. N Engl J Med. 364 (15), 1431-1440 (2011).
  6. Cypel, M., Neyrinck, A., Machuca, T. N. Ex vivo perfusion techniques: state of the art and potential applications. Intens Care Med. 45 (3), 354-356 (2019).
  7. Gouchoe, D. A., et al. XPS™ Jensen lung as a low-cost, high-fidelity training adjunct to ex-vivo lung perfusion. Artif Organs. , (2023).
  8. Van Raemdonck, D., Rega, F., Rex, S., Neyrinck, A. Machine perfusion of thoracic organs. J Thorac Dis. 10, S910-S923 (2018).
  9. Andreasson, A. S., Dark, J. H., Fisher, A. J. Ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation–state of the art. Eur J Cardiothorac Surg. 46 (5), 779-788 (2014).
  10. Ahmad, K., Pluhacek, J. L., Brown, A. W. Ex vivo lung perfusion: A review of current and future application in lung transplantation. Pulm Ther. 8 (2), 149-165 (2022).
  11. Kim, J. L., et al. Biometric profiling to quantify lung injury through ex vivo lung perfusion following warm ischemia. Asaio j. 69 (8), e368-e375 (2023).
  12. Jeon, J. E., et al. Acellular ex vivo lung perfusate silences pro-inflammatory signaling in human lung endothelial and epithelial cells. J Transl Med. 21 (1), 729 (2023).
  13. Baciu, C., et al. Altered purine metabolism at reperfusion affects clinical outcome in lung transplantation. Thorax. 78 (3), 249-257 (2023).
  14. Peel, J. K., et al. Evaluating the impact of ex vivo lung perfusion on organ transplantation: A retrospective cohort study. Ann Surg. 278 (2), 288-296 (2023).
  15. Peel, J. K., et al. Determining the impact of ex vivo lung perfusion on hospital costs for lung transplantation: A retrospective cohort study. J Heart Lung Transpl. 42 (3), 356-367 (2023).
  16. Warnecke, G., et al. Normothermic ex vivo preservation with the portable Organ Care System Lung device for bilateral lung transplantation (INSPIRE): a randomised, open-label, non-inferiority, phase 3 study. Lancet Respir Med. 6 (5), 357-367 (2018).
  17. Loor, G., et al. Portable normothermic ex vivo lung perfusion, ventilation, and functional assessment with the Organ Care System on donor lung use for transplantation from extended-criteria donors (EXPAND): a single-arm, pivotal trial. Lancet Resp Med. 7 (11), 975-984 (2019).
  18. Loor, G., et al. Prolonged EVLP using OCS lung: Cellular and acellular perfusates. Transplantation. 101 (10), 2303-2311 (2017).
  19. Bansal, S., Biswas, G., Avadhani, N. G. Mitochondria-targeted heme oxygenase-1 induces oxidative stress and mitochondrial dysfunction in macrophages, kidney fibroblasts and in chronic alcohol hepatotoxicity. Redox Biol. 2, 273-283 (2014).
  20. Park, S., et al. Initial investigation on the feasibility of porcine red blood cells from genetically modified pigs as an alternative to human red blood cells for transfusion. Front Immunol. 14, 1298035 (2023).
  21. Ellingson, K. D., et al. Continued decline in blood collection and transfusion in the United States-2015. Transfusion. 57, 1588-1598 (2017).
  22. Cuddington, C. T., et al. Pilot scale production and characterization of next generation high molecular weight and tense quaternary state polymerized human hemoglobin. Biotechnol Bioeng. 119 (12), 3447-3461 (2022).
  23. Moore, E. E., et al. Human polymerized hemoglobin for the treatment of hemorrhagic shock when blood is unavailable: the USA multicenter trial. J Am Coll Surg. 208 (1), 1-13 (2009).
  24. Shonaka, T., et al. Impact of human-derived hemoglobin based oxygen vesicles as a machine perfusion solution for liver donation after cardiac death in a pig model. PLoS One. 14 (12), e0226183 (2019).
  25. Chen, G., Palmer, A. F. Hemoglobin-based oxygen carrier and convection enhanced oxygen transport in a hollow fiber bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102 (6), 1603-1612 (2009).
  26. Bucci, E., Kwansa, H., Koehler, R. C., Matheson, B. Development of zero-link polymers of hemoglobin, which do not extravasate and do not induce pressure increases upon infusion. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 35 (1), 11-18 (2007).
  27. Schaer, C. A., et al. Haptoglobin preserves vascular nitric oxide signaling during hemolysis. Am J Respir Crit Care Med. 193 (10), 1111-1122 (2016).
  28. Muller, C. R., et al. Safety and efficacy of human polymerized hemoglobin on guinea pig resuscitation from hemorrhagic shock. Sci Rep. 12 (1), 20480 (2022).
  29. Greenfield, A., et al. Biophysical analysis and preclinical pharmacokinetics-pharmacodynamics of tangential flow filtration fractionated polymerized human hemoglobin as a red blood cell substitute. Biomacromolecules. 24 (4), 1855-1870 (2023).
  30. Cuddington, C., et al. Polymerized human hemoglobin-based oxygen carrier preserves lung allograft function during normothermic ex vivo lung perfusion. Asaio j. , (2024).
  31. Cabrales, P., et al. Effects of the molecular mass of tense-state polymerized bovine hemoglobin on blood pressure and vasoconstriction. J Appl Physiol. 107 (5), 1548-1558 (2009).
  32. Baek, J. H., et al. Down selection of polymerized bovine hemoglobins for use as oxygen releasing therapeutics in a guinea pig model. Toxicol Sci. 127 (2), 567-581 (2012).
  33. Williams, A. T., et al. Resuscitation from hemorrhagic shock with fresh and stored blood and polymerized hemoglobin. Shock. 54 (4), 464-473 (2020).
  34. Muller, C. R., et al. Resuscitation from hemorrhagic shock after traumatic brain injury with polymerized hemoglobin. Sci Rep. 11 (1), 2509 (2021).
  35. Lamb, D. R., et al. The molecular size of bioengineered oxygen carriers determines tissue oxygenation in a hypercholesterolemia guinea pig model of hemorrhagic shock and resuscitation. Mol Pharm. 20 (11), 5739-5752 (2023).
  36. Bobba, C. M., et al. A novel negative pressure-flow waveform to ventilate lungs for normothermic ex vivo lung perfusion. Asaio j. 67 (1), 96-103 (2021).
  37. Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. J Vis Exp. (96), e52309 (2015).
  38. Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World J Exp Med. 4 (2), 7-15 (2014).
  39. Wong, A., et al. Potential therapeutic targets for lung repair during human ex vivo lung perfusion. Eur Respir J. 55 (4), 1902222 (2020).
  40. Machuca, T. N., et al. The role of the endothelin-1 pathway as a biomarker for donor lung assessment in clinical ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transpl. 34 (6), 849-857 (2015).
  41. Gouchoe, D. A., et al. Mitsugumin 53 Mitigation of ischemia reperfusion injury in a mouse model. J Thorac Cardiovasc Surg. 10, (2023).
  42. Gouchoe, D. A., Whitson, B. A., Zhu, H. The next frontier in lung transplantation: Protecting the endothelium and repairing organs for transplant utilizing MG53. Clin Transl Dis. 3 (6), e255 (2023).
  43. Gouchoe, D. A., et al. MG53 mitigates warm ischemic lung injury in a murine model of transplantation. J Thorac Cardiovasc Surg. , (2023).

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Gouchoe, D. A., Lee, Y. G., Greenfield, A., Cuddington, C., Kim, J., Black, S. M., Palmer, A. F., Whitson, B. A. Exploring Alternative Perfusion Solutions Using Next-Generation Polymerized Hemoglobin-Based Oxygen Carriers in a Model of Rat Ex Vivo Lung Perfusion. J. Vis. Exp. (208), e66702, doi:10.3791/66702 (2024).

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