Aquí, describimos la aplicación de un portador de oxígeno basado en hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb) como perfusión y el protocolo en el que esta solución de perfusión se puede probar en un modelo de perfusión pulmonar ex vivo en ratas.
El trasplante de pulmón se ve obstaculizado por la falta de donantes adecuados. Anteriormente, se descartaban los donantes que se consideraban marginales o inadecuados. Sin embargo, una tecnología nueva y emocionante, como la perfusión pulmonar ex vivo (EVLP), ofrece a los proveedores de trasplantes de pulmón una evaluación ampliada para los aloinjertos de donantes marginales. Esta plataforma de evaluación dinámica ha provocado un aumento del trasplante pulmonar y ha permitido a los proveedores utilizar donantes que antes se descartaban, ampliando así el grupo de donantes. Las técnicas de perfusión actuales utilizan perfusionados celulares o acelulares, y ambos tienen ventajas y desventajas distintas. La composición de la perfusión es fundamental para mantener un entorno homeostático, proporcionar un apoyo metabólico adecuado, disminuir la inflamación y la muerte celular y, en última instancia, mejorar la función de los órganos. Las soluciones de perfusión deben contener una concentración de proteínas suficiente para mantener una presión oncótica adecuada. Sin embargo, las soluciones de perfusión actuales a menudo conducen a la extravasación de líquido a través del endotelio pulmonar, lo que resulta en edema y daño pulmonar inadvertido. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevas soluciones de perfusión que eviten el daño excesivo mientras mantienen una homeostasis celular adecuada. Aquí, describimos la aplicación de un portador de oxígeno basado en hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb) como perfusión y el protocolo en el que esta solución de perfusión se puede probar en un modelo de EVLP de rata. El objetivo de este estudio es proporcionar a la comunidad de trasplantes pulmonares información clave para el diseño y desarrollo de nuevas soluciones de perfusión, así como los protocolos adecuados para probarlas en modelos de trasplante traslacional clínicamente relevantes.
Como cualquier campo en el trasplante de órganos sólidos, el trasplante de pulmón sufre de una escasez de órganos de donantes. Con el fin de aumentar el grupo de donantes, se han dedicado importantes investigaciones a investigar el potencial de los aloinjertos que antes se pensaba que no eran adecuados para el trasplante, es decir, los donantes de criterio extendido (ECD). Estos aloinjertos pueden considerarse ECD por una serie de razones, que incluyen calidad cuestionable, mala función, infección, traumatismo, tiempos isquémicos cálidos o fríos prolongados y edad avanzada 1,2. En ciertos casos, en los que estos pulmones son adecuados para el trasplante inmediato3, a menudo es ventajoso tanto para los proveedores como para los receptores evaluar estos pulmones durante un tiempo adicional para determinar su idoneidad para el trasplante. La perfusión pulmonar ex vivo (EVLP) es una tecnología que permite una evaluación ampliada de posibles aloinjertos pulmonares en un circuito cerrado fuera del donante 2,4,5,6,7, lo que permite al proveedor del trasplante determinar la idoneidad del trasplante. La EVLP ha demostrado la capacidad de evaluar adecuadamente los órganos del donante 8,9,10,11, disminuir los efectos de la lesión por reperfusión isquémica (IRI)12,13 y aumentar el número de donantes14,15, lo que hace que el trasplante pulmonar sea un tratamiento más accesible para todos.
En general, un sistema EVLP es un sistema cerrado con un circuito ventilatorio (que se logra conectando un ventilador a la tráquea para introducir aire en el sistema) y un circuito vascular (que se logra conectando la aurícula izquierda (AI) a la arteria pulmonar (AP) con tubos)7. El circuito vascular tiene perfusión que corre a través del tubo para proporcionar al pulmón nutrientes vitales y oxígeno, al tiempo que limita el tiempo de isquemia fría (TCE)5,8,16,17. Esta solución es de base sanguínea (es decir, a través de la adición de glóbulos rojos empaquetados (PRBC))16,17 o de base acelular (es decir, sin PRBC)4,5. Sin embargo, existen varias desventajas notables en el uso de PRBC. Si se utilizan PRBC de donantes que murieron por traumatismo o donantes con muerte cerebral (BDD), estos fluidos a menudo contienen grandes cantidades de citocinas inflamatorias, lo que puede aumentar el daño celular durante la EVLP, así como aumentar los niveles de hemoglobina libre de células (Hb), hemo, hierro y fragmentos celulares que causan daño adicional a las células18,19. Además, dado que estos donantes suelen ser multiorgánicos, la recolección de PRBC antes de la obtención podría conducir a una disminución del volumen sanguíneo en el donante y, posteriormente, a un aumento de la isquemia en todos los órganos. Si se utilizan PRBC de otra fuente, los proveedores podrían enfrentar escasez de sangre, ya que este es un material escaso en sí mismo20,21. Por último, los PRBC son propensos a la lisis mecánica en el circuito EVLP, independientemente de su fuente, liberando Hb y otros componentes que contribuyen al daño celular.
Por lo tanto, por muchas razones, podría ser ventajoso utilizar un sustituto artificial de glóbulos rojos, es decir, portadores de oxígeno basados en hemoglobina (HBOC), como suplemento de perfusión. Un HBOC particularmente prometedor es la hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb). La poliHHb se sintetiza a partir de Hb purificada a partir de PRBC caducados que se consideraron inadecuados para la transfusión inmediata22. Se ha demostrado que son sustitutos viables de la sangre en el shock hemorrágico23 y en el trasplante24 y pueden producirse en grandes cantidades22. Sin embargo, la adopción a gran escala de PolyhHb no ha tenido éxito debido a complicaciones imprevistas como vasoconstricción, aumento de la presión arterial y paro cardíaco23,25. Las razones detrás de estos hallazgos probablemente se debieron a la presencia de Hb libre de células o polímeros de Hb de bajo peso molecular (< 500 kDa) en la solución de PolyhHb, ya que tienen una propensión a extravasarse al espacio tisular, lo que resultó en una disminución de la disponibilidad de óxido nítrico, vasoconstricción posterior, hipertensión sistémica y, finalmente, lesión oxidativa del tejido26,27. Para mejorar estos problemas, el Laboratorio Palmer ha trabajado en el desarrollo de una nueva generación de PolyhHb que contiene un mínimo de especies de bajo MW y Hb libre de células, que ha demostrado mejores características biofísicas y respuestas in vivo 22,28,29,30. Varios estudios de transfusión en animales han demostrado que si se eliminan los polímeros de Hb de bajo peso molecular del HBOC, se pueden mitigar la vasoconstricción, la hipertensión sistémica y el daño oxidativo 28,29,31,32,33,34,35. Por lo tanto, esto convierte a este PolyhHb de próxima generación en un candidato prometedor para perfundir.
Aquí, describimos la aplicación de un PolyhHb de próxima generación para ser utilizado en una perfusión y el protocolo por el cual esta solución de perfusión puede ser probada en un modelo de EVLP de rata. El objetivo de este estudio es proporcionar a la comunidad de trasplantes pulmonares información clave para el diseño y desarrollo de nuevas soluciones de perfusión, así como proporcionar protocolos para probarlas en modelos de trasplante traslacional clínicamente relevantes.
El desarrollo y las pruebas de soluciones de perfusión es un esfuerzo novedoso en el que se están embarcando muchas personas en todo el mundo. Tradicionalmente, las perfusiones estándar ofrecen la capacidad de suspender el tiempo isquémico y mitigar las lesiones asociadas a la isquemia, así como la reperfusión18. Sin embargo, la próxima evolución de la EVLP es mejorar la tecnología actual de perfusión, así como incorporar terapias de reparación y reaco…
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación fue generosamente apoyada por el Jewel and Frank Benson Family Endowment y la Cátedra de Investigación Jewel and Frank Benson. B.A.W. cuenta con el apoyo parcial de la subvención de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) R01HL143000. A.F.P. cuenta con el apoyo de las subvenciones de los NIH R01HL126945, R01EB021926, R01HL131720 y R01HL138116 y de la W81XWH1810059 de subvenciones del Comando de Investigación Médica y Material del Ejército de los EE. UU. S.M.B. cuenta con el apoyo de la DK123475 NIH R01.
10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needle | B-D | 309301 | |
30 L Glass Batch Bioreactor | Ace Glass | ||
30g Needle | Med Needles | BD-305106 | |
Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets | Elanco | NA | |
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma Aldrich | 10035-04-8 | For modified Ringer's lactate |
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 | Harvard Apparatus | 731747 | |
Connect kit D150 | Cole-Parmer | VK 73-3763 | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11252-50 | |
Dumont Medical #5/45 Forceps – Angled 45° | Fine Science tools | 11253-25 | |
Ecoline Star Edition 003, E100 Water Heater | Lauda | LCK 1879 | |
Expired human leukoreduced, packed RBC units | Wexner Medical Center Canadian Blood Services Zen-Bio Inc |
||
Fiberoxygenator D150 | Hugo Sachs Elektronik | PY2 73-3762 | |
Forceps | Fine Science tools | 11027-12 | |
Glutaraldehyde (C5H8O2 70 wt%) | Sigma Aldrich | 111-30-8 (G7776) | |
Halsted-Mosquito Hemostat | Roboz Surgical | RS-7112 | |
Heparin 30,000 units per 30 ml | APP Pharmaceuticals | ||
Human Serum Albumin (HSA) | OctaPharma Plasma | Perfusate additive | |
IL2 Tube set for perfusate | Harvard Apparatus | 733842 | |
IPL-2 Basic Lung Perfusion System | Harvard Apparatus | ||
Ketamine 500 mg per 5 ml | JHP Pharmaceuticals | ||
Left Atrium cannula | Harvard Apparatus | 730712 | |
Liqui-Cel EXF Series G420 Membrane Contactor | 3M | G420 | gas contactor |
low potassium dextran glucose solution (perfadex) | XVIVO | solution flushing the lung | |
Masterflex Platinum Coated Tubing(Size: 73,17,16,24) | Cole-Palmer | ||
N-Acetyl-L-cysteine (NALC, C5H9NO3S) | Sigma Aldrich | 616-91-1 (A7250) | For modified Ringer's lactate |
Nalgene Vessels (10L, 20L) | Nalgene | Filtration vessels | |
Peristaltic Pump | Ismatec | ISM 827B | |
PES, 0.65 µm TFF module | Repligen | N02-E65U-07-N | |
PhysioSuite | Kent Scientific Corporation | PS-MSTAT-RT | |
polyethersulfone (PES), 0.2 µm TFF module | Repligen | N02-S20U-05-N | |
Polysulfone (PS), 500 kDa TFF module | Repligen | N02-P500-05-N | |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For PBS |
PowerLab 8/35 | ADInstruments | 730045 | |
Pulmonary Artery cannula | Harvard Apparatus | 730710 | |
Pump Head tubing (Size: 73,17,16,24) | PharMed BPT | ||
Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | NA | |
Scissors | Fine Science tools | 14090-11 | |
SCP Servo controller for perfusion type 704 | Harvard Apparatus | 732806 | |
Small Animal Ventilator model 683 | Harvard Apparatus | 55-000 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 7647-14-5 (S271-10) | For PBS and saline |
Sodium cyanoborohydride (NaCNBH3) | Sigma Aldrich | 25895-60-7 | |
Sodium Dithionite (Na2S2O4) | Sigma Aldrich | 7775-14-6 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | 1310-73-2 | For modified Ringer's lactate |
Sodium Lactate (NaC3H5O3) | Sigma Aldrich | 867-56-1 | For modified Ringer's lactate |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Fisher Scientific | 7558-79-4 | For PBS |
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Fisher Scientific | 7558-80-7 | For PBS |
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-MVG-Module | |
Sprague-Dawley rats | Envigo | ||
TAM-A transducer amplifier module type 705/1 | Harvard Apparatus | 73-0065 | |
TAM-D transducer amplifier type 705/2 | Harvard Apparatus | 73-1793 | |
TCM time control module type 686 | Harvard Apparatus | 731750 | |
Tracheal cannula | Harvard Apparatus | 733557 | |
Tube set for moist chamber | Harvard Apparatus | 73V83157 | |
Tubing Cassette | Cole-Parmer | IS 0649 | |
Tweezer #5 Dumostar | Kent Scientific Corporation | INS500085-A | |
Tweezer #5 stainless steel, curved | Kent Scientific Corporation | IND500232 | |
Tweezer #7 Titanium | Kent Scientific Corporation | INS600187 | |
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm ID | Harvard Apparatus | 721017 | perfusate line entering lung |
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm ID | Harvard Apparatus | 721019 | perfusate line leaving lung |
Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
VCM ventilator control module type 681 | Harvard Apparatus | 731741 | |
William's E Media | Gibco, ThermoFisher Scientific | A12176-01 | Perfusate additive |
Xylazine 100 mg per 1 ml | Akorn |