Summary

Un modelo de dolor inflamatorio modificado para estudiar el efecto analgésico en ratones

Published: November 15, 2024
doi:

Summary

Aquí, presentamos un modelo de dolor inflamatorio modificado con la inyección de carragenina en ambas patas traseras para evaluar el efecto analgésico.

Abstract

La prueba de la placa caliente es ampliamente utilizada para evaluar los efectos analgésicos sobre el dolor inflamatorio en ratones. Un modelo de dolor inflamatorio comúnmente utilizado fue inducido con una inyección intraplantar de carragenina en una pata trasera. Sin embargo, los hallazgos de nuestro laboratorio mostraron que los ratones con una sola inyección de carragenina en la pata trasera levantaron las patas para evitar la nocicepción térmica durante la prueba de la placa caliente. Debido a esta respuesta, el método de inyección anterior no puede reflejar con precisión el umbral de dolor térmico. Por lo tanto, investigamos un nuevo método para evitar este problema. En el presente estudio, modificamos el método anterior inyectando carragenina en ambas patas traseras para establecer el modelo de dolor inflamatorio. Los resultados demostraron que la inyección de carragenina en ambas patas traseras fue sensible y un mejor método para inducir dolor inflamatorio cuando se utilizó la prueba de la placa caliente que la inyección de una sola pata trasera. Sobre la base de estos hallazgos, diseñamos nuevos experimentos en los que los ratones con inyección de carragenina en ambas patas traseras o en una sola pata trasera fueron tratados por vía intragástrica con celecoxib (30 mg/kg). Los resultados de la prueba de la placa caliente mostraron que celecoxib aumentó el umbral de dolor térmico en ratones con inyección de carragenina en ambas patas traseras, pero no en ratones con inyección de carragenina en una sola pata trasera. En resumen, desarrollamos un método superior para inducir un modelo de dolor inflamatorio para evaluar el efecto analgésico.

Introduction

El dolor es un problema de salud pública en todo el mundo. Se desencadena por estimulación térmica, mecánica o química nociva. Es difícil realizar estudios del dolor en humanos debido a preocupaciones éticas. Por lo tanto, el uso de modelos animales de dolor es un enfoque clave para comprender los mecanismos del dolor y los tratamientos de investigación1. La prueba de la placa caliente ha sido ampliamente utilizada para la evaluación de la nocicepción térmica y la hiperalgesia2. Actualmente, el modelo de dolor inflamatorio utilizado para la prueba de la placa caliente se induce con una inyección intraplantar de carragenina en una pata trasera. Por ejemplo, para investigar el efecto antinociceptivo de las microesferas cargadas de rotigotina, se preparó un modelo animal de dolor inflamatorio mediante una inyección en una sola pata trasera3. Para evaluar los efectos de los inhibidores de la catecol-o-metiltransferasa sobre la nocicepción térmica en ratones, se administró carragenina en la región plantar de la pata trasera derecha4. Para investigar el papel analgésico del extracto de Posidonia oceanica (L.) Delile, se preparó un modelo de dolor inflamatorio en ratones mediante inyección intraplantar de carragenina en la pata trasera derecha5. Sin embargo, los hallazgos de nuestro laboratorio mostraron que un ratón con la inyección de carragenina en una sola pata trasera levantaría su pata para evitar la nocicepción térmica, lo que extiende incorrectamente la respuesta del animal a un estímulo térmico en la prueba de la placa caliente. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el modelo de dolor inflamatorio con la inyección de carragenina en una sola pata trasera no podía reflejar con precisión el umbral de dolor térmico. Por lo tanto, optimizamos el método inyectando carragenina en ambas patas traseras para establecer un modelo de dolor inflamatorio modificado.

Los ratones sometidos a la inyección de carragenina en ambas patas traseras no tenían forma de evitar el estímulo térmico de ambas patas traseras al mismo tiempo. El umbral del dolor se definió como el tiempo que transcurre desde que el ratón coloca el ratón en la placa caliente hasta que el ratón lame cualquiera de las patas traseras. Los resultados confirmaron que el modelo de dolor inflamatorio modificado es más adecuado para evaluar el umbral de temperatura nociceptivo. Esto puede mejorar la eficacia de la prueba de la placa caliente para la investigación y el desarrollo de fármacos analgésicos.

Protocol

El protocolo experimental fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yantai (No. YTDX20220425). Los procedimientos siguieron las Pautas de los Institutos Nacionales de Salud para el Uso de Animales de Laboratorio. 1. Animales Utilice ratones hembra ICR que pesen entre 20 y 25 g para los experimentos. Permita que los animales se aclimaten al entorno de la sala experimental durante 3 días antes de comenzar los experimentos. Mantenga la sala experimental con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y proporcione a los ratones acceso libre al agua y la comida. 2. Preparación de la solución de carragenina Pesa 0,1 g de carragenina. Agregue 10 mL de solución salina normal esterilizada a un tubo. Añadir 0,1 g de carragenina al tubo y agitar el tubo durante 30 s. Recoja la solución de carragenina esterilizada al 1%. Prepare la solución de carragenina antes de los experimentos. 3. Inyección intraplantar de carragenina Use una jeringa (0,05 ml, 29 g x 1/2 pulgada, 0,33 mm × 12,7 mm) para inyectar la solución de carragenina al 1%. Agite la solución de carragenina antes de introducirla en la jeringa. Asegúrese de que no haya burbujas en la jeringa. Desinfecte el lugar de la inyección (pata trasera) con alcohol al 75%. Inyectar 30μL 6,7 de solución de carragenina al 1% por vía subcutánea en la superficie plantar de la pata trasera. Para los ratones del grupo de control, inyectar 30 μL de solución salina normal.Inserte la aguja en diagonal hacia arriba en la almohadilla del pie de la pata trasera. Mantener la estabilidad de la jeringa. Después de la inyección, retire la jeringa lentamente y presione el lugar de la inyección durante 2 segundos para evitar fugas. 4. Prueba de placa caliente Realice la prueba de la placa caliente 3 h después de la inyección intraplantar. Limpie y desinfecte la superficie de la placa calefactora. Encienda el aparato de placa calefactora. Haga clic en el botón Modo de temperatura . Haga clic en CONSTANTE para ajustar la temperatura a 55 ± 0,2 °C. Haga clic en el botón Iniciar experimento y haga clic en REACH. Tome un ratón del contenedor de alojamiento. Agarra suavemente su tronco. Coloque el mouse en el centro de la placa calefactora. Haga clic en INICIO. Observe y registre el tiempo para lamer la pata trasera izquierda (para ratones con inyección de una sola pata trasera) o la pata trasera (para ratones con inyección de ambas patas traseras) en respuesta a la estimulación del calor. Presione el pedal de la placa calefactora para ver la hora en la pantalla de la placa calefactora. Defina el umbral de dolor como el tiempo que transcurre desde que se coloca el ratón en la placa caliente hasta que se lame la pata trasera. Establezca un límite de 60 s para la prueba de la placa caliente 4,8,9. Registre un umbral de dolor de 60 s si se alcanza el límite.NOTA: Limpie el aparato de placa caliente con alcohol al 75% antes de colocar el siguiente mouse para evitar posibles sesgos debido al olor residual del mouse anterior. 5. Preparación de 1,5 mg/mL de suspensión de celecoxib Tomar 1 cápsula que contiene 200 mg de celecoxib. Obtén el contenido de la cápsula y muélela hasta convertirla en polvo. Añadir carboximetilcelulosa sódica al 0,5%. El volumen final es de 13,3 mL. Esta es la suspensión de celecoxib. Tome 1 mL de la suspensión de celecoxib de la tienda. Añadir 9,0 mL de carboximetilcelulosa sódica al 0,5% para obtener 1,5 mg/mL de suspensión de celecoxib. Administrar 0,2 mL/10 g de la suspensión de celecoxib por vía intragástrica a los ratones.NOTA: Seleccione una aguja de sonda nasogástrica de 4,0-4,5 cm de longitud para ratones que pesen entre 20 y 25 g. 6. Evaluación del modelo de dolor inflamatorio modificado Divida aleatoriamente ratones hembra ICR en tres grupos: grupos de control, modelo y celecoxib. Inyectar 30 μL de solución de carragenina al 1% por vía subcutánea en la superficie plantar de la pata trasera (pata trasera simple o pata trasera ambas). Para los ratones del grupo de control, inyectar 30 μL de solución salina normal. Después de la inyección de carragenina o solución salina normal, realice el tratamiento inmediatamente. Administración intragástrica de celecoxib a una dosis de 30 mg/kg para los ratones del grupo de celecoxib. Para los ratones de los grupos control y modelo, administrar por vía intragástrica carboximetilcelulosa sódica al 0,5%. Realice la prueba de la placa caliente (sección 2) a las 3 h después de la inyección de carragenina. 7. Métodos estadísticos Presentar los resultados experimentales como media ± desviación estándar. Realice una prueba de distribución de normalidad con la prueba estadística de bondad de ajuste de Kolmogorov-Smirnov. Analice la comparación entre los dos grupos utilizando una prueba t no apareada. Realice comparaciones de múltiples grupos utilizando un análisis de varianza unidireccional seguido de la prueba de Dunnett. Considere que el valor de p < 0,05 es estadísticamente significativo.

Representative Results

El umbral del dolor en los modelos de dolor inflamatorioEl umbral de dolor del modelo de dolor inflamatorio con inyección de carragenina en una sola pata trasera fue de 32,23 ± 11,11 s, mientras que el umbral de dolor del grupo control fue de 27,73 ± 7,08 s. En comparación con el grupo control, el umbral de dolor del modelo de inyección de una sola pata trasera no mostró una reducción significativa (p > 0,05, Figura 1A). El umbral…

Discussion

El dolor es una respuesta protectora desencadenada por un daño o lesión en los tejidos. Sin embargo, también tiene un impacto negativo en la calidad de vida10. Por lo tanto, el desarrollo de analgésicos efectivos y la exploración de los mecanismos del dolor siguen siendo áreas activas de investigación. Los métodos de evaluación del dolor desempeñan un papel clave en el desarrollo de fármacos analgésicos. La inyección de carragenina en una sola pata tr…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Lesley McCollum, PhD, de Liwen Bianji (Edanz) (www.liwenbianji.cn), por editar el texto en inglés de un borrador de este manuscrito.

Materials

AL204 electronic balance Yuheng Battery Co., Ltd  YH-400A
Carboxymethylcellulose Tianjin Chemical Co., Ltd  20210326
Carrageenan Sigma, MO, USA 29H0715
Celecoxib Pfizer Inc. 8142838
Hot plate  UGO Ltd. Co., Italy PB-200 
ICR female mice Jinan Pengyue  Co., Ltd. SCXK20220007
Normal saline Kelun Pharmaceutical Co., Ltd  H51021157

Referencias

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Citar este artículo
Huiwen, L., Baiyang, Z., Yongkang, W., Xue, J., Jiren, Z., Pinyuan, Z., Tian, W. A Modified Inflammatory Pain Model to Study the Analgesic Effect in Mice. J. Vis. Exp. (213), e66701, doi:10.3791/66701 (2024).

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