Método de bioimpresión de alto rendimiento para modelar la permeabilidad vascular en placas estándar de seis pocillos con flexibilidad de tamaño y patrón

La red vascular en todo el cuerpo humano funciona como una barrera de transporte crucial al regular dinámicamente el intercambio de moléculas y células entre la sangre y los tejidos circundantes. Esta regulación es esencial para prevenir el edema tisular y permitir el intercambio selectivo de nutrientes y células, apoyando así el metabolismo y la homeostasis de los tejidos¹. La alteración de la permeabilidad endotelial, un factor en muchas condiciones de salud, afecta tanto a la gravedad de la enfermedad como a la eficacia del tratamiento². El endotelio vascular actúa como una barrera selectiva, facilitando la transferencia entre vasos, tejidos y órganos. Esta regulación involucra varios mecanismos, como el filtrado básico de solutos y moléculas pequeñas, la disrupción intencional de la barrera vascular y la influencia de moléculas como prostaglandinas y factores de crecimiento en los niveles de permeabilidad³.

Los factores clave en esta regulación incluyen las uniones de células endoteliales, la migración de leucocitos y la funcionalidad de la barrera hematoencefálica⁴. Dada su complejidad, el proceso varía en diferentes entornos, involucrando varios tipos de vasos sanguíneos y utilizando distintas vías anatómicas. Comprender los fundamentos biológicos de la permeabilidad vascular es crucial para diseñar enfoques terapéuticos para tratar las afecciones asociadas con la permeabilidad vascular anormal. Mantener la permeabilidad vascular es crucial para la salud del sistema vascular y los tejidos circundantes; En consecuencia, el deterioro de esta función conduce a la disfunción endotelial, un estado en el que el endotelio pierde su funcionalidad normal.

La disfunción endotelial es precursora de varias enfermedades humanas prevalentes, como la hipertensión, la enfermedad de las arterias coronarias, la diabetes y el cáncer ^5,6,7. Esta afección puede presentarse de varias maneras, incluyendo una disminución de la vasodilatación, un aumento de la permeabilidad de los vasos y una tendencia hacia un estado proinflamatorio. Este estado patológico es la etapa más temprana de varios problemas cardiovasculares críticos, como la enfermedad de las arterias coronarias, el accidente cerebrovascular y la enfermedad arterial periférica⁸, que continúan siendo las principales causas de mortalidad en los Estados Unidos¹. La disfunción endotelial afecta a la salud cardiovascular, así como a la barrera hematoencefálica (BHE) y desempeña un papel importante en la progresión de diversos trastornos neurológicos. La disfunción puede aumentar la permeabilidad de la BBB, permitiendo así que las toxinas, los patógenos y las células inmunitarias se infiltren en el sistema nervioso central y contribuyan a trastornos neurológicos como el accidente cerebrovascular, la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis múltiple y las infecciones^cerebrales.

La disfunción endotelial en la diabetes se caracteriza por el compromiso de la capacidad del endotelio para regular el tono vascular y producir mediadores vasodilatadores, como el óxido nítrico, lo que conduce a una vasodilatación alterada¹⁰. Esta condición se ve exacerbada por vías inducidas por la hiperglucemia, como la activación de la proteína quinasa C y el estrés oxidativo, contribuyendo significativamente a la progresión de la enfermedad vascular diabética¹¹. Además, se ha descubierto que un entorno inflamatorio mejora la adhesión de las células tumorales a las células endoteliales microvasculares del cerebro, mientras que se ha informado que un endotelio permeable es un factor importante en la metástasis del cáncer^12,13. Se ha descubierto que la geometría de los vasos sanguíneos influye directamente en la metástasis del cáncer cerebral. Las células tumorales se adhieren preferentemente a las áreas de mayor curvatura de los vasos sanguíneos⁷. Este hallazgo subraya la importancia de la geometría vascular en la metástasis del cáncer. Más importante aún, en condiciones como la fibrosis y el cáncer, la alteración de la función de la barrera endotelial no solo desempeña un papel en el desarrollo de la enfermedad, sino que también dificulta la efectividad del tratamiento al dificultar la administración adecuada de medicamentos¹⁴. La investigación sobre la permeabilidad vascular es crucial para avanzar en el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares y ofrecer información sobre el manejo de otras enfermedades que implican una función vascular comprometida.

Dado el papel crucial de la permeabilidad vascular en la salud y la enfermedad, una considerable cantidad de investigación se ha centrado en examinar la naturaleza selectiva de la barrera endotelial para el desarrollo terapéutico mediante el uso de modelos animales, junto con plataformas tradicionales de pruebas in vitro en 2D y 3D. Sin embargo, los modelos animales tienen limitaciones debido a las diferencias específicas de cada especie y a cuestiones éticas, así como a los altos costos^15,16. Por ejemplo, Pfizer, en 2004, declaró que durante los 10 años anteriores, había gastado más de 2.000 millones de dólares en desarrollos de fármacos que mostraban efectos prometedores en modelos animales, pero que finalmente fracasaron^{en las etapas} avanzadas de pruebas en humanos. Además, los modelos 2D tradicionales no imitan con precisión la arquitectura tridimensional (3D) y la compleja estructura geométrica de los canales vasculares.

Con los avances en las tecnologías de biofabricación, se han realizado grandes esfuerzos para fabricar canales vasculares mientras se recapitula la arquitectura 3D. Los canales vasculares a microescala se pueden fabricar de manera efectiva dentro de chips microfluídicos mediante el uso de litografía blanda, lo que ofrece una ventaja del análisis en tiempo real^18,19. Se pueden utilizar métodos alternativos, como la fundición en hidrogel o el envoltorio de láminas de celdas alrededor de un molde o mandril, para crear estructuras tubulares independientes con el diámetro deseado^20,21. Sin embargo, estos métodos tienen limitaciones; Por ejemplo, los chips microfluídicos están restringidos a configuraciones de microcanales, y la fundición de hidrogel alrededor de un molde no replica eficazmente múltiples geometrías.

Con la aparición de la tecnología de bioimpresión^{3D 22}, se ha hecho posible replicar geometrías complejas mediante el depósito preciso de diversos materiales de hidrogel basados en matriz extracelular (ECM)^23,24. Algunos métodos de bioimpresión, como los que utilizan boquillas dispuestas concéntricamente, por ejemplo, coaxial y triaxial^25,26, no pueden crear tubos bifurcados; Sin embargo, las estructuras complejas se pueden lograr con métodos de patrones de sacrificio²⁷. No se ha demostrado que ninguno de estos métodos de bioimpresión permita un modelado in vitro de alto rendimiento, un requisito crucial para la investigación farmacológica en el descubrimiento de fármacos. En este trabajo, presentamos un método para fabricar eficientemente canales vasculares endotelizados con un control eficiente sobre las dimensiones.

Establecimos un enfoque sencillo utilizando placas de seis pocillos disponibles en el mercado, combinadas con un método de patrón de sacrificio en el que una bioimpresora fabrica canales vasculares de los tamaños y patrones deseados dentro de un hidrogel ECM. Se sembraron células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) para endotelizar estos canales y evaluar la funcionalidad del endotelio a través de un ensayo de permeabilidad. Este diseño permite la perfusión sin bomba mediante la creación de depósitos de medios a ambos lados del canal y utiliza el flujo impulsado por la gravedad con la ayuda de un balancín 2D de uso común para imitar la cultura dinámica. Este enfoque elimina la necesidad de bombas peristálticas y facilita la escalabilidad de esta plataforma para aplicaciones de alto rendimiento. La naturaleza controlada por ordenador de la tecnología de bioimpresión 3D también agiliza el proceso de fabricación, disminuyendo así la probabilidad de errores durante la fabricación. El modelo VOP se muestra prometedor como una herramienta valiosa para las pruebas farmacológicas en el descubrimiento de fármacos.