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Neurociencias

Isolamento, expansão e nucleofecção de células-tronco neurais da zona subventricular murina adulta

Published: June 14, 2024
doi:
10.3791/66651
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1Instituto de Biotecnología y Biomedicina (BIOTECMED), Departamento de Biología Celular, Biología Funcional y Antropología Física,Universitat de València

Summary

Aqui, descrevemos um sistema de nucleofecção projetado para aumentar a eficiência da entrega de genes em células-tronco neurais expandidas (NSCs) isoladas da zona subventricular murina adulta. Os resultados demonstram que este método melhora significativamente a perturbação gênica em NSCs, superando a eficácia dos protocolos tradicionais de transfecção e aumentando a taxa de sobrevivência celular.

Abstract

O isolamento e a expansão de células-tronco neurais (NSCs) da zona subventricular (SVZ) do cérebro de camundongos adultos podem ser alcançados em um meio suplementado com fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) e fator de crescimento epidérmico (EGF) como mitógenos, produzindo agregados clonais conhecidos como neuroesferas. Este sistema in vitro é uma ferramenta valiosa para estudar o potencial do NSC. A transfecção de siRNAs ou genes transportados em plasmídeos pode ser usada para induzir perturbações na expressão gênica e estudar a biologia do NSC. No entanto, a entrega de ácidos nucleicos exógenos às culturas de NSC é desafiadora devido à baixa eficiência da transfecção de células do sistema nervoso central (SNC). Aqui, apresentamos um sistema de nucleofecção aprimorado que atinge alta eficiência de entrega de genes em NSCs expandidos de SVZ murina adulta. Demonstramos que este método relativamente simples aumenta a perturbação gênica em NSCs adultos, superando os protocolos tradicionais de transfecção com taxas de sobrevivência superiores a 80%. Além disso, este método também pode ser aplicado em NSCs isolados primários, proporcionando um avanço crucial nos estudos da função gênica por meio da manipulação da expressão gênica por meio de knockdown ou superexpressão em culturas de neuroesferas.

Introduction

As células-tronco neurais (NSCs) são células-tronco multipotentes residentes no cérebro. Essas células possuem a capacidade de se auto-renovar e se diferenciar nas três linhagens neurais: astrócitos, oligodendrócitos e neurônios1. Consequentemente, os NSCs desempenham um papel crucial na neurogênese adulta em mamíferos, um processo em que novos neurônios são gerados no cérebro2. As NSCs residem predominantemente em duas regiões dentro do cérebro adulto denominadas nichos neurogênicos: a zona subventricular (SVZ) ao longo das paredes dos ventrículos laterais e a zona subgranular (SGZ) dentro do giro dentado do hipocampo 3,4. As NSCs (também conhecidas como células B) na SVZ, o nicho neurogênico mais ativo no camundongo adulto, se auto-renovam e produzem progenitores amplificadores de trânsito (TAPs ou células C) que subsequentemente se diferenciam em neuroblastos (células A). Esses neuroblastos migram através do fluxo migratório rostral (RMS) para os bulbos olfatórios (OB), onde sofrem diferenciação completa em interneurônios, integrando-se ao circuito pré-existente 3,4,5,6.

Compreender a intrincada interação de pistas e sinais moleculares que regulam as NSCs dentro desses nichos é importante para aproveitar seu potencial para aplicações terapêuticas. Para tanto, vários métodos têm sido desenvolvidos para estudar essa população celular, desde a cultura primária seletiva de CPNs até a seleção celular por meio de marcadores de superfície 7,8,9,10. O presente manuscrito detalha o isolamento e a cultura de NSCs SVZ in vitro usando um meio seletivo livre de soro contendo ambos os mitógenos: fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) e fator de crescimento epidérmico (EGF). Este meio facilita a proliferação celular e mantém a estaminalidade das NSCs obtidas a partir da SVZ de cérebros de camundongos adultos, formando agregados clonais, tridimensionais e não aderentes in vitro conhecidos como neuroesferas9. As culturas de neuroesferas servem como uma plataforma controlada para manipular e estudar os mecanismos moleculares e fatores que afetam a proliferação, auto-renovação, diferenciação e sobrevivência do NSC11. Notavelmente, o número de neuroesferas primárias formadas na cultura permite uma estimativa do número de NSCs presentes na SVZ in vivo, tornando-a uma ferramenta poderosa para estudar os efeitos de diferentes condições no pool de NSC adulto12,13. Além disso, uma vez estabelecida a cultura primária, as NSCs podem gerar novos agregados (neuroesferas secundárias) ao passar por divisões simétricas sob condições de proliferação14. Assim, a semeadura de baixa densidade de células secundárias da neuroesfera (ensaio clonal) pode ser utilizada para avaliar a taxa de auto-renovação dessas culturas 4,15,16,17.

Apesar do potencial das neuroesferas em descobrir os mecanismos que regem a regulação do NSC, alguns pesquisadores questionam a validade dos achados in vitro, argumentando que as condições artificiais nas quais as células crescem podem não replicar fielmente o intrincado microambiente in vivo de nichos neurogênicos 18,19,20,21,22. Outro ponto controverso gira em torno da heterogeneidade observada nas neuroesferas. No entanto, acredita-se que essa variabilidade espelhe as divisões simétricas e assimétricas das NSCs que ocorrem naturalmente in vivo23,24. Além disso, a validação recente apoiou a utilização de culturas de NSC para prever mecanismos que operam dentro do nicho neurogênico da SVZ in vivo, e vários estudos demonstraram que NSCs cultivadas in vitro mantêm com precisão o perfil transcriptômico observado in vivo11,25.

Portanto, as culturas de neuroesferas não servem apenas como um método para explorar as habilidades de proliferação e diferenciação do NSC, mas também oferecem um sistema para estudar a influência dos genes que governam a biologia do NSC. Uma técnica fundamental para investigar a função gênica em NSCs é a perturbação da expressão gênica. siRNAs ou genes entregues por meio de plasmídeos podem ser transfectados em culturas de células, resultando em knockdown ou regulação positiva do gene alvo. Essa abordagem versátil reduz significativamente o tempo e o custo em comparação com o estabelecimento de culturas usando camundongos knockout condicionais, apresentando um caminho promissor para desvendar as bases genéticas da neurogênese e explorar perspectivas terapêuticas. Alterar a expressão de genes específicos em NSCs permite a modulação de seu comportamento, influenciando processos biológicos cruciais, como proliferação, diferenciação e migração. No entanto, a perspectiva de transfectar NSCs, particularmente nas neuroesferas de camundongos, apresenta desafios notáveis. A estrutura tridimensional das neuroesferas compromete a eficiência da transfecção, muitas vezes resultando em baixas taxas de entrega bem-sucedida de ácidos nucleicos exógenos, o que limita a extensão da manipulação genética26,27. Além disso, os procedimentos de transfecção podem afetar negativamente a viabilidade e a funcionalidade celular27. Nesse contexto, apresentamos o sistema de nucleofecção como um método para mitigar o dano celular, alcançando uma alta taxa de sobrevivência e garantindo maior eficácia em ensaios de entrega gênica usados para perturbar culturas de NSC.

Este manuscrito tem como objetivo ilustrar o procedimento para isolar, expandir e nucleofectar NSCs do nicho neurogênico SVZ adulto para perturbar genes usando o sistema de cultura de neuroesferas. Este método supera a eficácia dos protocolos tradicionais de transfecção, apresentando taxas de sobrevivência significativamente mais altas e melhor eficiência de entrega de genes entre as células-alvo.

Protocol

Todos os experimentos realizados com animais foram previamente aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Valência e autorizados pela Conselleria de Agricultura, Ganadería y Pesca, Generalitat Valenciana (Espanha). 1. Cultura primária de neuroesferas Preparação de reagentesPrepare uma solução tampão de tampão de solução salina fosfato de Dulbecco (DPBS) em água deionizada e esterilize em autoclavagem. Alternativamente, prepare 0,1 M PBS pH 7,4 adicionando 137 mM de NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 e 1,8 mM KH2PO4 solução em água deionizada. Encha duas placas de 12 poços com DPBS previamente resfriadas e mantenha-as no gelo: uma será usada para preservar todo o cérebro antes da dissecação e a outra preservará as SVZs dissecadas até o processamento do tecido. Prepare a mistura enzimática contendo papaína conforme descrito abaixo.Prepare a solução de dissociação EDTA/L-cisteína na solução salina balanceada de Earl (EBSS) até uma concentração final de 0,2 mg/mL cada. Para obter a dissolução completa, incubar o tubo em banho-maria a 37 °C. Dissolva 12 U/ml de papaína em solução de EDTA/L-cisteína. Considere que 500 μL de solução enzimática serão usados por cérebro. Introduzir solução de papaína em banho-maria a 37 °C durante cerca de 20 minutos até que a enzima se dissolva completamente. Filtrar-esterilizar a mistura enzimática com uma seringa e um filtro de poros de 0,22 μm e mantê-la a 4 °C até à utilização.NOTA: A papaína é ativada após 30 min a 37 °C e pode ser armazenada por 12 h a 4 °C. Preparar o meio de cultura de controlo adicionando a solução de mistura hormonal de acordo com a Tabela 1 e esterilizá-lo com filtros de poros de nitrocelulose de 0,22 μm. Manter o meio a 4 °C e aquecê-lo em banho-maria a 37 °C antes de utilizar. Prepare o meio completo suplementando o meio de controle com EGF e bFGF antes de usar conforme a Tabela 1. Não filtre o meio completo, pois os mitógenos podem ser perdidos com a filtragem. Extração cerebral e dissecção da SVZNOTA: Os ratos têm livre acesso a comida e água antes da eutanásia. São usados camundongos C57BL/6 com 8 a 16 semanas de idade. Ambos os sexos são usados sem diferenças perceptíveis na preparação.Esterilize as ferramentas de dissecção em autoclavagem antes da cirurgia. Em seguida, mergulhe bisturis, pinças, tesouras e espátulas em um copo cheio de etanol a 70%. Limpe bem todas as superfícies de trabalho com etanol 70%. Sacrifique o camundongo por overdose de CO2 e confirme por luxação cervical. Pulverize a cabeça com etanol 70% para minimizar a possibilidade de contaminação do tecido cerebral. Separe a cabeça do mouse do resto do corpo usando uma tesoura. Corte a pele acima do crânio com uma tesoura pequena ao longo do eixo rostro-caudal até que o crânio esteja completamente descoberto. Exponha o cérebro cortando inicialmente o crânio ao longo da sutura sagital com uma tesoura pequena e, em seguida, remova os ossos usando uma pinça fina. Tenha cuidado para não causar nenhum dano ao tecido cerebral abaixo do crânio durante esta etapa. Extraia cuidadosamente o cérebro do crânio usando uma espátula e coloque-o em uma placa de 12 poços contendo DPBS fria. Mantenha a placa no gelo até que a dissecção seja concluída. Transfira todo o cérebro para a almofada de silicone onde ocorrerá a dissecção e aplique algumas gotas de DPBS fria sobre o cérebro (Figura 1A). Use um bisturi para remover o BO localizado na extremidade rostral do cérebro e o cerebelo situado na parte caudal, mantendo a porção central do cérebro contendo ambos os ventrículos laterais (Figura 1B). Divida o cérebro ao longo da fissura longitudinal em dois hemisférios e, em seguida, prossiga com a dissecção de ambos os hemisférios separadamente (Figura 1C). Trabalhando com um hemisfério, reoriente-o para que a área medial fique voltada para cima. Abra o cérebro ao longo da linha do corpo caloso, separando o córtex e o estriado do hipocampo, septo e diencéfalo, expondo assim os ventrículos laterais (Figura 1D).NOTA: A ZVS está situada entre a cavidade do ventrículo e o corpo estriado, portanto, as etapas subsequentes visam isolar a ZVS com a maior precisão possível do tecido circundante. Remova o hipocampo, septo e diencéfalo seguindo o limite ventral dos ventrículos (Figura 1E, F), o tecido além das extremidades rostral e caudal da SVZ ( Figura 1G ) e o córtex seguindo o corpo caloso ( Figura 1 H , I ). Incline o tecido de modo que a SVZ fique voltada para o lado (Figura 1J), permitindo a remoção do tecido estriatal abaixo da SVZ (Figura 1K) para obter um pedaço fino de tecido contendo as NSCs (Figura 1L). Armazene as duas SVZs dissecadas do mesmo camundongo em uma placa de 12 poços contendo DPBS estéril e fria até que o processamento do tecido comece.NOTA: A dissecção de ambas as SVZs de um cérebro deve levar 10 minutos. Um tempo mais longo pode afetar a viabilidade celular. Se for necessário um aumento no rendimento das culturas, SVZs de vários camundongos da mesma idade, sexo, histórico genético e genótipo podem ser agrupados. Isolamento e semeadura de NSCsCorte cada SVZ em 4-5 pedaços pequenos para facilitar a desagregação do tecido.NOTA: A partir desta etapa, todo o procedimento deve ser realizado em condições estéreis em uma capela de fluxo laminar. Transfira as SVZs picadas para um tubo de centrífuga de 15 mL usando uma pipeta Pasteur de plástico estéril. Certifique-se de que não haja fragmentos na placa. Deixe o tecido sedimentar no fundo do tubo e remova o DPBS restante. Adicione 500 μL de mistura enzimática filtrada contendo papaína por cérebro (2 SVZs) e incube os tubos em banho-maria a 37 ° C por 30 min. Após a incubação, adicionar 5 ml de meio de controlo pré-aquecido a 37 °C a cada amostra. Centrifugue as amostras a 300 x g por 5 min. Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma micropipeta ou uma bomba de vácuo. Adicione 1 mL de meio controle e desagregue mecanicamente cuidadosamente o pellet, pipetando para cima e para baixo de 10x a 20x, usando uma pipeta de vidro Pasteur polida a fogo até obter uma suspensão de célula homogênea.CUIDADO: Esta é uma das etapas mais críticas do protocolo, pois a desagregação excessiva ou insuficiente afetará negativamente o rendimento das culturas. Adicione 4 mL de meio de controle e misture por inversão para lavar as células. Centrifugue a 300 x g por 5 min. Em seguida, remova o sobrenadante. Adicione 1 mL de meio completo e ressuspenda o pellet pipetando para cima e para baixo 10x para homogeneizar a suspensão celular. Conte a suspensão celular usando uma câmara de Neubauer sob o microscópio depois de diluir 1/2 alíquota da suspensão celular com azul de tripano ou utilize um contador automático de células. Certifique-se de que as culturas sejam desagregadas no nível de uma única célula. Uma vez preparada a suspensão celular, semeie as células obtidas igualmente em 8 poços de uma placa de 48 poços em um volume final de 500 μL de meio completo.NOTA: Normalmente obtemos 20.000 células de duas SVZs, resultando em uma densidade final de semeadura de aproximadamente 2.500 células/mL para atingir o rendimento máximo em culturas. Formação de neuroesferasIncubar células por 5 a 7 dias in vitro (DIV) em uma incubadora umidificada a 37 ° C e 5% de CO2. Nessas condições, células diferenciadas morrem enquanto NSCs e progenitores proliferam em resposta à estimulação mitogênica, formando agregados clonais reconhecidos como neuroesferas primárias.NOTA: Tanto o EGF quanto o bFGF podem ser usados para induzir a formação de neuroesferas. No entanto, esses dois fatores de crescimento não são totalmente substituíveis. Verifique o tamanho das neuroesferas usando uma câmera acoplada ao microscópio invertido e, quando as neuroesferas atingirem uma faixa de tamanho de 50 a 100 μm, conte todas as neuroesferas primárias formadas no poço com ampliação de 10x. O número total de neuroesferas primárias formadas serve como uma estimativa do número de NSCs presentes no nicho SVZ. Após um período de 10 dias, colete o meio de cultura de cada poço para começar a passar. Conduza a passagem subsequente após 5 a 7 DIV, embora seja importante notar que as esferas primárias podem exigir uma duração um pouco maior para atingir o tamanho ideal para subcultura (cerca de 100 μm). Tabela 1: Soluções de meios de cultura. A receita do meio de controle é descrita. Uma solução de mistura hormonal pré-misturada é feita. As soluções de hormonas de reserva podem ser preparadas com antecedência, conforme indicado, e armazenadas a -20 °C. Antes da cultura celular, suplementar o meio de controlo com EGF e bFGF para preparar o meio completo. Especificações de armazenamento, estoques e concentrações de trabalho são fornecidos para cada componente. Clique aqui para baixar esta tabela. 2. Expansão das culturas da neuroesfera Passagem de neuroesferasColete o meio contendo as neuroesferas das placas de poços múltiplos e transfira-os para um tubo de centrífuga de 15 mL. Garanta a recuperação do maior número possível de células enxaguando os poços com alguns mililitros de DPBS. Centrifugue as neuroesferas por 5 min a 300 x g. Em seguida, remova o sobrenadante. Adicione 200 μL de solução enzimática (consulte a Tabela de Materiais) ao pellet e bata suavemente no fundo do tubo para desalojá-lo. Incube por 10 min em temperatura ambiente para facilitar a dissociação das neuroesferas. Adicione 1 mL de meio de controle para interromper a reação enzimática e dissociar mecanicamente as neuroesferas com uma micropipeta P1000 pipetando para cima e para baixo de 10x a 20x. Adicione um volume adicional de 4 mL do meio de controle e misture por inversão para lavar as células. Centrifugue as células por 5 min a 300 x g. Em seguida, remova o sobrenadante. Adicione 1 mL de meio completo e ressuspenda o pellet para homogeneizar a suspensão celular pipetando para cima e para baixo 10x.NOTA: Se o número e o tamanho originais das neuroesferas forem muito altos, adicione um meio mais completo para diluir a suspensão celular, garantindo uma contagem confiável de células. Conte a suspensão celular usando uma câmara de Neubauer depois de diluir 1/2 alíquota da suspensão celular com azul de tripano ou utilize um contador automático de células. Para expandir a cultura celular, semeie células a uma densidade de 10.000 células/cm2 usando meio completo em uma placa de cultura ou frasco apropriado (ver Tabela 2). Incubar células para 5 a 7 DIV em uma incubadora umidificada a 37 ° C e 5% de CO2 para cada passagem.NOTA: As culturas de neuroesferas podem ser consistentemente expandidas e propagadas por meio de subculturas repetidas, não excedendo 10 passagens, sem alterar suas capacidades de proliferação. Tanto o EGF quanto o bFGF podem ser utilizados para cultura; no entanto, a expansão a longo prazo das culturas só pode ser alcançada na presença do EGF. Ensaio de autorrenovaçãoApós passar pelas culturas da neuroesfera, coloque 1.000 células individuais em uma placa de 96 poços, completando até um volume final de 200 μL com meio completo, resultando em uma densidade celular final das culturas de 5 células/μL.NOTA: O número de células propagadas deve ser o mais preciso possível. Se necessário, preparar diluições intermédias para assegurar um volume de suspensão celular fiável antes da plaqueagem. Além disso, recomenda-se plaquear 4 a 5 repetições por condição para reduzir a variabilidade técnica. Incubar células a 37 °C e 5% de CO2 em uma incubadora umidificada por 5 dias ou até que as neuroesferas atinjam um tamanho adequado (60 a 100 μm). Evite mover ou sacudir a placa multipoços para evitar a agregação da neuroesfera. Após a formação da neuroesfera, conte o número de neuroesferas formadas em cada poço usando um microscópio de contraste de fase invertido equipado com uma câmera acoplada. O ensaio de auto-renovação pode ser realizado usando EGF ou bFGF separadamente. Criopreservação de culturas NSCNOTA: As culturas de neuroesferas podem ser criopreservadas para uso futuro, minimizando o número de camundongos necessários. Recomendamos preservar as células até a passagem 10.Para criopreservar células, transfira 1 mL da suspensão celular em meio completo para um criotubo devidamente marcado. Adicione dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração final de 10% à suspensão celular e misture suavemente invertendo os tubos.NOTA: O DMSO serve como crioprotetor, mas pode ser tóxico para as células, portanto, esta etapa deve ser realizada rapidamente. Coloque os tubos em um freezer de -80 °C usando um recipiente de congelamento que permita uma diminuição gradual da temperatura a 1 °C/min. Este processo de congelamento gradual evita danos celulares causados pela formação de cristais de gelo durante a criopreservação. Para armazenamento de longo prazo, mantenha os tubos em um tanque de nitrogênio líquido a -196 °C. Descongelamento de culturas NSCNOTA: Quando necessário, as células podem ser descongeladas e as culturas reexpandidas para experimentos.Remover os tubos criogênicos contendo NSCs congelados do tanque de armazenamento de nitrogênio líquido e colocá-los imediatamente em banho-maria a 37 °C até que estejam completamente descongelados, aproximadamente 5 min.CUIDADO: É crucial minimizar o tempo de banho, pois o DMSO é tóxico e pode afetar a viabilidade celular. Transfira rapidamente as células descongeladas para um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 5 mL de meio de controle pré-aquecido. Centrifugue as células a 300 x g por 5 min e remova o sobrenadante. Adicione 1 mL de meio completo e ressuspenda o pellet pipetando suavemente para cima e para baixo 10x para homogeneizar a suspensão celular antes da semeadura.NOTA: O descongelamento pode afetar a viabilidade celular; portanto, recomenda-se passar as células pelo menos uma vez antes da semeadura para novos experimentos. Teste de micoplasmaNOTA: A contaminação por micoplasma pode comprometer a saúde celular, afetando as taxas de crescimento. Portanto, o teste de micoplasma é crucial para garantir a integridade e confiabilidade dos experimentos.Extração de DNAColete um mínimo de 100 μL da cultura de células para extração de DNA. Tanto o sobrenadante quanto o pellet celular podem ser usados para extração de DNA. Conservar esta alíquota a -20 °C até à extracção. Furar a tampa do tubo e ferver a alíquota a 99 °C durante 15 minutos com um termobloco.NOTA: A perfuração das tampas dos tubos evita a abertura dos tubos durante a fervura em altas temperaturas. Centrifugue por 5 min a 16.900 x g. Transfira o sobrenadante contendo o DNA para um novo tubo. Conservar o tubo com o ADN a -20 °C até ao teste PCR. PCR para detecção de MycoplasmaPrepare a mistura de PCR usando os seguintes componentes: 8,9 μL de água livre de nuclease, 3 μL de tampão de reação 5x, 1,2 μL de 25 mM MgCl2, 0,25 μL de 2,5 mM dNTPs, 0,15 μL de Taq polimerase e 0,25 μL de cada primer específico do micoplasma a uma concentração de 10 μM (Forward, Fw: 5’GATGTTTAGCCGGGTCGAGAG3′ e Reverse, Rv: 5’GATGTCAAGAGTGGGTAAGGTT3′). Adicione 1 μL de DNA genômico extraído. Prepare a mistura de PCR em uma capela de fluxo laminar para evitar a contaminação do DNA. Incubar a reação em um termociclador da seguinte forma: desnaturação inicial a 95 °C por 5 min, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 s, recozimento a 53 °C por 1 min, extensão a 72 °C por 30 s e extensão final a 72 °C por 5 min. Para identificar o tamanho da banda resultante (cerca de 500 pb), carregue 15 μL do produto de PCR de DNA misturado com 3 μL de solução de corante de carga 6x em um gel de agarose a 2% e execute a eletroforese por 40 a 50 min a 100 V. Quadro 2: Placas e frascos utilizados para cultura. As dimensões e volumes das placas e frascos de semeadura mais comumente usados são fornecidos. A tabela inclui o diâmetro, a área de crescimento e o volume médio usado para cada vaso, juntamente com um exemplo do número de NSCs a serem semeados em condições de expansão (10.000 células/cm2). Clique aqui para baixar esta tabela. 3. Nucleofecção de culturas de neuroesferas Preparação de reagentesPreparação de DNAPrepare 25 μL de células E . coli DH5α competentes em um tubo de 1,5 mL para transformação. Adicionar 1 μl do plasmídeo de interesse (a 100 a 200 ng/μl) às células e submetê-las a um choque térmico a 42 °C durante 45 s. Aqui, um plasmídeo contendo um grampo curto (sh)RNA para silenciar a expressão de Snrpn e um plasmídeo de controle shSCRAMBLE são usados.NOTA: Mantenha as células competentes no gelo durante todo o procedimento para manter a eficácia da transformação. Colocar as células transformadas em placas de ágar-LB com o antibiótico adequado e incubá-las a 37 °C durante 18 h. Mantenha as placas de Petri invertidas para evitar a formação de gotículas devido à condensação, que pode perturbar as colônias bacterianas.NOTA: Adicione antibióticos apropriados ao meio de cultura LB para permitir exclusivamente o crescimento de bactérias transformadas. Usando uma ponta de pipeta estéril, pegue colônias bacterianas individuais e transfira-as para um frasco Erlenmeyer previamente preenchido com 250 mL de LB para iniciar uma cultura líquida. Evite escolher pequenas colônias satélites posicionadas ao redor das colônias-alvo maiores, pois elas podem não ter incorporado o plasmídeo desejado. Incubar o balão agitando vigorosamente num agitador orbital a 37 °C durante a noite. Utilize um kit maxiprep livre de endotoxinas e extraia DNA de plasmídeo puro das culturas bacterianas seguindo as instruções do fabricante. Reconstituir o DNA no volume apropriado de água livre de endotoxinas para obter uma concentração de plasmídeo de 1 a 2 μg/μL.NOTA: O rendimento do maxiprep depende do crescimento da cultura. Normalmente, ressuspender o pellet de DNA do plasmídeo em um volume de 200 μL resultará na concentração de DNA desejada. Conservar o tubo com o ADN plasmidial a -20 °C até à utilização. Preparar um tubo de 1,5 ml com um volume final de 5 μL contendo 2 a 6 μg do ADN plasmidial destinado à nucleofecção. Preparação do materialPreparar a solução de nucleofecção. Se estiver usando o kit recomendado (consulte a Tabela de Materiais), prepare 95 μL da solução de nucleofecção em um tubo de 1,5 mL para cada nucleofecção desejada. Pipetas e cubetas geralmente estão incluídas no kit. Prepare um de cada para cada condição de nucleofecção. Prepare um balão T25 cheio de 4 mL de meio completo pré-aquecido por condição e mantenha-o na incubadora até o uso. Nucleofecção de NSCsUse 1 a 2 x 106 células individuais por condição para avaliação. Centrifugue as células por 5 min a 300 x g e, em seguida, remova o sobrenadante. Adicione 1 mL de DPBS e ressuspenda o pellet pipetando para cima e para baixo 10x para garantir uma suspensão celular homogênea. Repetir a centrifugação (passo 2.1.6) para uma segunda lavagem e, por fim, ressuspender o sedimento em 95 μl de solução de nucleofecção.NOTA: As etapas de lavagem são cruciais para remover os antibióticos do meio de controle e garantir uma nucleofecção eficaz. Combine os 95 μL de células com uma solução pré-misturada contendo 5 μL de cada plasmídeo (2 μg no total) selecionado para nucleofecção. Usando uma micropipeta P200, transfira esta solução para uma cubeta e coloque-a no dispositivo nucleofector. Nucleofecte as células com os plasmídeos desejados usando o programa NSC otimizado do sistema nucleofector. Depois de completar a eletroporação, introduza cuidadosamente o meio completo quente na cubeta usando as pipetas Pasteur fornecidas no kit. Em seguida, transferir o conteúdo da cubeta para um balão T25 previamente preparado contendo meio completo pré-aquecido. Após a eletroporação, pode haver morte celular, precipitação de DNA e formação de um agregado viscoso. Evite transferi-lo para o frasco T25, pois pode reduzir a sobrevivência celular.NOTA: Esta etapa é crucial e deve ser realizada o mais rápido possível para garantir um alto rendimento de nucleofecção e subsequente sobrevivência da cultura. Incubar células nucleofecadas a 37 °C e 5% de CO2 em uma incubadora umidificada por 3 a 5 dias. Seleção de células nucleofectadasEstratégia A: Seleção de citometria de fluxo por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS)Após 3 a 5 dias de nucleofecção, passar as culturas nucleofectadas seguindo o passo 2.1 e coletar todas as células individualizadas obtidas. Filtre as amostras através de um filtro de células de 40 μm para remover os agregados celulares e analisá-los com o citômetro de fluxo do classificador de células.NOTA: É crucial classificar o mesmo número de células em cada condição para obter resultados comparativos. Usando o software do citômetro, bloqueie as células vivas com base em duas medidas: luz espalhada direta (FSC-A) que corresponde ao tamanho da célula e luz espalhada lateral (SSC-A) que corresponde à complexidade intracelular. Selecione a população de células vivas caracterizadas por alto FSC-A e alto SSC-A.NOTA: Opcionalmente, adicione 0,1 μg / mL de 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) à suspensão celular antes da classificação. Isso permitirá o descarte de células mortas e corpos apoptóticos do gating. Descarte os duplicatos e trigêmeos de células plotando os parâmetros FSC-A versus FSC-H. Escolha os eventos incluídos na diagonal do gráfico, representando singlets.NOTA: Quando as células passam pelo laser, o citômetro detecta voltage mudanças ao longo do tempo. FSC-A representa a área do sinal e FSC-H significa altura do pico. Os singlets mostram uma relação proporcional entre FSC-A e FSC-H (localizado na diagonal do gráfico), enquanto os agregados de células exibem um FSC-A maior em relação ao FSC-H devido a um sinal mais longo. Selecione células nucleofectadas com base na intensidade de fluorescência do gene repórter codificado pelo plasmídeo usado. Por exemplo, ao usar GFP +, as células podem ser selecionadas com base nos níveis de fluorescência FITC-A versus gráfico SSC-A. Isole o número desejado de células-alvo para cada condição e colete-as diretamente em um tubo de coleta cheio de meio completo. Semeie NSCs nucleofectados a uma densidade de 10.000 células/cm2. Incubar as culturas de células selecionadas a 37 °C e 5% de CO2 em uma incubadora umidificada. Estratégia B: Seleção usando resistência a antibióticos codificada no plasmídeoApós 48 h de nucleofecção, adicione a concentração apropriada de antibiótico para selecionar células resistentes.NOTA: Antes de começar, recomenda-se testar várias concentrações do antibiótico em células não nucleofectas. A concentração ideal de antibiótico é a menor quantidade na qual todas as células não resistentes são eliminadas. Por exemplo, determinamos uma concentração ideal de 4 μg/mL de antibiótico blasticidina para culturas NSC. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2 em uma incubadora umidificada por 48 h. Após 48 h de tratamento com antibióticos, subcultive as células nucleofecadas de acordo com a etapa 2.1. Se as neuroesferas permanecerem pequenas, remova o antibiótico do meio de cultura por centrifugação a 300 x g por 5 min. Ressuspender as células e cultivá-las num balão utilizando apenas o meio completo. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2 numa incubadora humidificada até que possam ser expandidas seguindo o passo 2.1.

Representative Results

Condições ideais de cultura permitem o isolamento e a expansão de NSCs derivados de SVZ adultos in vitroCulturas de NSCs derivadas da SVZ adulta têm servido como um valioso método in vitro para investigar os mecanismos moleculares e sinais de nicho que regulam as NSCs em seus microambientes específicos. O ensaio da neuroesfera descrito neste manuscrito foi empregado para examinar a contagem de NSC dentro da SVZ adulta. O tecido SVZ foi isolado do cérebro de camundongos de 3 meses de idade, dissociado e cultivado em meio NSC completo suplementado com EGF e bFGF ou cada um separadamente. Após 10 dias in vitro (DIV), a contagem total de esferas primárias formadas nessas três condições distintas de cultivo foi quantificada usando microscopia de contraste de fase (Figura 2A,B). Notavelmente, nossos achados demonstram que a presença de EGF levou à formação máxima de esferas primárias, o que é evidente a partir da contagem reduzida de esferas primárias observada em culturas com apenas bFGF (Figura 2A, B). Para avaliar a capacidade de auto-renovação das NSCs em condições de meio variadas, as células foram subcultivadas e plaqueadas em baixa densidade (5 células/μL) em meio suplementado com as combinações de mitógenos acima mencionadas. A quantificação das esferas secundárias revelou que os NSCs da SVZ precisam de pelo menos EGF para se auto-renovar com eficiência e que a combinação de EGF e bFGF melhora a capacidade de auto-renovação das células (Figura 2B). Além disso, para uma análise detalhada da dinâmica de crescimento em diversas condições de meio, foi registrado o número de células semeadas e obtidas ao longo de 7 passagens. As curvas de crescimento obtidas de diferentes condições de meio confirmaram que as culturas suplementadas com EGF sozinho ou em combinação com bFGF exibiram melhor dinâmica de crescimento em comparação com culturas suplementadas apenas com bFGF (Figura 2C). Coletivamente, esses achados comprovam que o uso simultâneo de EGF e bFGF aumenta o rendimento da cultura NSC in vitro. A fim de investigar a contagem de NSC dentro da SVZ em diferentes idades pós-natais e avaliar o impacto do envelhecimento de camundongos na eficiência da cultura de neuroesferas, o tecido SVZ de camundongos com idade entre 1 mês e 12 meses foi dissecado. Notavelmente, nossos achados revelaram um declínio significativo no número de esferas primárias com o aumento da idade, mostrando eficiência máxima na contagem de esferas por volta dos 2 a 4 meses de idade (Figura 2D). Além disso, para avaliar a capacidade de auto-renovação das NSCs durante o subcultivo, as NSCs de camundongos com idade entre 2 e 4 meses foram subcultivadas e semeadas em densidade clonal (5 células/μL) em meio completo. A quantificação do número de esferas secundárias ao longo das passagens subsequentes indicou uma diminuição considerável na eficiência da cultura ao longo das passagens (Figura 2E). Com base em todas essas observações, recomenda-se a realização de ensaios de auto-renovação durante as primeiras passagens para otimizar ainda mais as condições de cultura do NSC. A nucleofecção é uma técnica altamente eficiente para manipular a expressão gênica em NSCs adultosDado que as NSCs não são facilmente transfectáveis, para manipular a expressão gênica, apresentamos aqui um protocolo de nucleofecção com maior taxa de entrega gênica bem-sucedida sem a necessidade de usar transdução viral. Após a dissecção e cultura de SVZs individuais de camundongos de 2 a 4 meses de idade, os NSCs foram nucleofecados com um plasmídeo portador de GFP, conforme descrito ( Figura 3A ). A detecção de células GFP-positivas 2 dias após a nucleofecção revelou uma eficiência variando de 30% a 50%, consistente com a literatura anterior28. Para isolar especificamente NSCs nucleofectados com sucesso, as células foram classificadas por FACS com base na intensidade de fluorescência GFP 3 a 5 dias após a nucleofecção (Figura 3A-C). Aproximadamente 40% das células analisadas pré-FACS exibiram altos níveis de fluorescência GFP e foram posteriormente selecionadas por classificação (Figura 3C). A ressemeadura de NSCs GFP+ classificados mostrou que todas as células eram GFP positivas, validando o método de isolamento celular baseado em nucleofecção (Figura 3D). Notavelmente, os NSCs nucleofectados mantiveram a viabilidade por meio de passagens subsequentes, confirmando a viabilidade da nucleofecção para NSCs adultos. Esses resultados enfatizam a eficácia da combinação de nucleofecção e FACS para estabelecer uma cultura pura de NSCs modificados. Como exemplo de modulação gênica em NSCs adultos, a atenuação gênica via nucleofecção de RNA em grampo curto (sh) foi empregada. Especificamente, um shRNA direcionado ao gene do polipeptídeo N da ribonucleoproteína nuclear pequena (Snrpn), carregando um repórter CAG-GFP (shSNRPN) foi nucleofectado em culturas NSC derivadas de camundongos de 2 meses de idade. A regulação negativa de Snrpn foi confirmada por qPCR e imunocitoquímica em células nucleofecadas com o plasmídeo shSNRPN, mas não para o plasmídeo shSCRAMBLE de controle ( Figura 3E , F ) 29 . Para elucidar os efeitos da regulação negativa do Snrpn na capacidade de auto-renovação do NSC, um ensaio de baixa densidade foi realizado em células nucleofectadas ( Figura 3F , G ). A quantificação de neuroesferas secundárias em culturas nucleofectadas revelou um aumento da capacidade de formação de neuroesferas após a regulação negativa de Snrpn ( Figura 3G ). Este ensaio ressalta a capacidade de nucleofecção de manipular a expressão gênica em NSCs adultos e, mais especificamente, identifica o papel do Snrpn na manutenção da stemness em NSCs adultos. Figura 1: Descrição detalhada da dissecção da SVZ. (A) Depois de remover o cérebro do camundongo, todo o cérebro é transferido com DPBS para uma almofada de silicone para dissecação. (B) OB e cerebelo são removidos do cérebro usando um bisturi. (C) O cérebro é dividido em dois hemisférios para prosseguir com a dissecção separadamente. (D) O cérebro é aberto ao longo da linha do corpo caloso, separando o córtex e o estriado do hipocampo, septo e diencéfalo, expondo assim os ventrículos laterais. (E-F) O hipocampo, o septo e o diencéfalo são removidos seguindo o limite ventral dos ventrículos. (G-I) O tecido além das extremidades rostral e caudal da SVZ e do córtex é removido seguindo o corpo caloso. (JK) O tecido é inclinado para que a SVZ fique voltada para os lados, permitindo a remoção do tecido estriatal abaixo da SVZ. (L) Um pedaço fino de tecido contendo a SVZ é obtido. Linhas tracejadas pretas indicam o local de corte. As linhas pontilhadas pretas indicam a localização da SVZ em cada etapa. Abreviaturas: OB = bulbo olfatório; CB = cerebelo. Barra de escala em A-H: 5 mm; em I-L: 3 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Ambos os mitógenos EGF e bFGF são necessários para uma cultura e expansão ideais de NSCs in vitro. (A) Imagens de microscopia de contraste de fase de culturas de neuroesferas primárias e secundárias em meio NSC suplementadas com EGF e bFGF ou cada mitógeno separadamente. (B) Número de esferas primárias obtidas por camundongo e por poço com base na composição mitogênica do meio de cultura: sem mitógenos (cinza, n = 9), EGF + bFGF (azul, n = 33), apenas EGF (verde, n = 20) ou apenas bFGF (rosa, n = 19; painel esquerdo). Número de neuroesferas secundárias formadas em baixa densidade (5 células/μL) por poço com base na composição mitogênica do meio de cultura): sem mitógenos (cinza, n=11), bFGF (rosa, n=18), EGF (verde, n=18) ou EGF+bFGF (azul, n=37; painel direito). Utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis com análise post hoc de Dunn. (C) Curvas de crescimento mostrando o número total de células formadas após 8 passagens em culturas distintas de neuroesferas de acordo com os mitógenos presentes no meio de cultura: bFGF (rosa, n=5), EGF (verde, n=5) ou EGF+bFGF (azul, n=10). A análise de regressão linear foi usada. (D) O número de neuroesferas primárias derivadas de camundongos individuais dissecados e desagregados de animais em vários estágios de desenvolvimento pós-natal. A análise de regressão linear foi usada. n indicado entre parênteses. (E) O número de neuroesferas secundárias formadas em baixa densidade (5 células / μL) por meio de passagens subsequentes in vitro para avaliar sua capacidade de auto-renovação. Utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis, sendo incluídos valores de p: *: p<0,05; **: p<0,01; : p<0,001; : p<0,0001. N.S: Não significativo. As barras de erro representam o SEM. A barra de escala em A é de 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Esquema do processo de nucleofecção e seleção celular baseada em FACS de células nucleofecadas. (A) Visão geral do processo de nucleofecção e seleção celular baseada em FACS de células nucleofecadas. 1) A solução de DNA de plasmídeo é combinada com a solução de nucleofecção e adicionada às células. Esta mistura é então transferida para uma cubeta para nucleofecção. 2) A cubeta contendo DNA e células é inserida no nucleofector, onde é aplicado um choque elétrico. Para culturas de neuroesferas isoladas da SVZ adulta, recomendamos o uso do programa A-031 NSC. 3) Após a nucleofecção, as células são transferidas para um frasco contendo meio completo suplementado com EGF e bFGF. 4) As células são classificadas por FACS com base na expressão do repórter contido no DNA do plasmídeo. 5) As células classificadas passam por mais cultura para experimentos subsequentes. (B) Estratégia de seleção baseada em FACS e gating para NSCs nucleofectos. Primeiro, as células vivas são selecionadas com base no alto FSC-A e no alto SSC-A (gráfico à esquerda) e, em seguida, os duplos e trigêmeos de células são eliminados pela análise dos parâmetros FSC-A versus FSC-H (gráfico à direita). (C) Bloqueio FACS para células nucleofectadas com base em sua expressão de GFP (SSC-A versus fluorescência FITC-A). (D) Microscopia de contraste de fase e imagens de fluorescência GFP de NSCs nucleofectadas antes (n = 3) e depois (n = 4) da seleção de FACS (painel esquerdo). A porcentagem de células GFP+ nucleofectadas é representada antes e depois da seleção do FACS (painel direito). O teste t foi usado. (E) Análise quantitativa de PCR (qPCR) da expressão de Snrpn em NSCs em proliferação nucleofectada com shRNA específico de Snrpn (n = 4). A nucleofecção usando um scramble de shRNA serviu como controle (n = 4). O teste t foi usado. (F) Imagens de imunocitoquímica exibindo SNRPN (em vermelho) em NSCs 7 dias após a nucleofecção de shRNA (painéis externos). DAPI foi utilizado para contra-coloração de DNA. Imagens representativas representando neuroesferas derivadas de NSCs sob condições shSNRPN e shSCRAMBLE (painéis intermediários). (G) Quantificação do número de neuroesferas formadas em culturas NSC após nucleofecção com shSNRPN (n = 8) ou shSCRAMBLE (n = 8). O teste t foi usado. valores de p estão incluídos: *: p<0,05; **: p<0,01; : p<0,001; : p<0,0001. N.S: Não significativo. As barras de erro representam o SEM. Barra de escala em D, 10 μm; em F, 100 μm (imagens de alta ampliação em F, 7 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Devido à falta de marcadores definitivos para identificar a população de NSCs in vivo, a análise de NSCs tem sido baseada principalmente na observação do comportamento de células isoladas de nichos neurogênicos em condições ex vivo . O trabalho pioneiro de Reynolds e Weiss lançou as bases estabelecendo condições precisas de cultura, permitindo o isolamento e a expansão de células individuais de tecido SVZ de camundongo adulto jovem (2 meses de idade) sob condições não adesivas. Essas células são geralmente propagadas em um meio livre de soro contendo EGF e bFGF, condições que impedem totalmente a diferenciação em neurônios e glia enquanto promovem a proliferação. De fato, sob essas condições de cultura9, a maioria das células morre durante os primeiros dias de cultura, mas um pequeno subconjunto começa a se dividir e forma principalmente neuroesferas flutuantes9. A dissociação enzimática e o subcultivo desses agregados celulares facilitam a propagação da cultura, demonstrando a capacidade de autorrenovação dessas culturas.

Notavelmente, as culturas de neuroesferas mostram potencial de expansão com a adição apenas de EGF, enquanto as NSCs cultivadas em um meio contendo apenas bFGF não mostram proliferação celular a longo prazo30. Ambas as evidências apontam o EGF como o principal mitógeno de auto-renovação do NSC. No entanto, a presença de EGF e bFGF no meio de cultura melhora a capacidade de auto-renovação das NSCs31, bem como contribui para equilibrar o potencial de diferenciação em astrócitos, neurônios e oligodendrócitos 32,33,34,35. Além disso, o uso de uma mistura definida de hormônios e fatores em vez de alternativas comerciais para suplementar o meio garante a alta qualidade e reprodutibilidade das culturas NSC. Nessas condições, as culturas de NSC de camundongos podem persistir como linhagens celulares estáveis sem sofrer imortalização. No entanto, uma preocupação nas culturas de neuroesferas é o potencial das populações de células proliferativas de sofrer transformações genéticas, contornando os mecanismos reguladores do ciclo celular e levando a um fenótipo imortalizado. Portanto, embora as culturas de neuroesferas sejam altamente expansíveis, culturas além de 10 passagens in vitro são geralmente descartadas para estudos, pois podem sofrer envelhecimento replicativo, e células com conteúdo cromossômico anormal ou dinâmica de crescimento irregular podem surgir. Além disso, o uso de culturas de neuroesferas estabelecidas a longo prazo deve ser monitorado continuamente. As culturas de neuroesferas também oferecem a oportunidade de examinar suas características e potencial em um ambiente controlado, fornecendo uma configuração mais precisa e ajustável que pode ser modulada e monitorada com mais precisão do que in vivo. Por meio de análises clonogênicas ou populacionais in vitro, é possível quantificar as capacidades de auto-renovação e proliferação dessas células, facilitando a identificação dos mecanismos subjacentes que governam essas propriedades.

No entanto, apesar da grande lista de vantagens de trabalhar com NSCs in vitro, a natureza desse protocolo de cultura e a delicadeza dos NSCs constituem um desafio no campo. Por exemplo, o número de neuroesferas primárias geradas durante uma dissecção típica pode variar significativamente com base na habilidade e precisão do experimentador. Os resultados da neuroesfera primária ilustram essa variabilidade no número de neuroesferas primárias obtidas da SVZ de camundongos de 2 meses de idade, variando entre 500 e 3000 neuroesferas. Vários fatores podem contribuir para essa variabilidade. Primeiro, a precisão da dissecção minimiza o tecido parenquimatoso indesejado, que inibe a formação de esferas primárias. Em segundo lugar, a geração de pequenos pedaços de tecido SVZ permite a digestão enzimática e trituração eficientes, reduzindo assim a perda celular. Isso destaca a necessidade de prática prévia suficiente do protocolo de dissecção e um desenvolvimento ajustado do processamento de tecidos durante o estabelecimento das culturas da neuroesfera.

Outra limitação dessas culturas reside no fato de que as neuroesferas podem compreender tanto NSCs quanto células progenitoras, tornando difícil distinguir entre essas duas populações dentro de culturas primárias. Embora vários marcadores como GFAP, Nestin, Musashi e SOX2 tenham sido relatados como expressos por NSCs8, nenhum deles foi associado exclusivamente a NSCs. Técnicas emergentes de FACS baseadas na expressão de antígenos de superfície celular permitiram o isolamento de NSCs e sua progênie. Esses estudos demonstraram que os progenitores amplificadores de trânsito são incapazes de formar neuroesferas após a passagem 25,36. Assim, embora a relação entre as células SVZ e as células iniciadoras da neuroesfera exija mais refinamento 18,19,20,21,22,23, a capacidade das neuroesferas de serem passadas em série por um período prolongado pode refletir a presença de NSCs nas culturas.

Este sistema de cultura de neuroesferas tem servido como um modelo robusto para investigar o impacto das vias de sinalização e expressão gênica na manutenção da capacidade de autorrenovação do NSC in vitro15,29. Uma abordagem para explorar esses aspectos envolve a transfecção de NSCs para superexpressar ou derrubar genes específicos. Isso pode ser feito por meio de várias técnicas, incluindo métodos virais e não virais. Embora os vetores virais geralmente atinjam alta eficiência de transferência de genes, eles têm limitações importantes, como os altos requisitos de segurança e a produção demorada de vetores26. Por outro lado, os métodos clássicos de transfecção, como lipofecção e eletroporação, atingem taxas de transfecção muito baixas, tornando-os inviáveis para células difíceis de transfectar. A tecnologia de nucleofecção oferece uma abordagem fácil de usar, combinando soluções de nucleofecção específicas do tipo de célula com parâmetros elétricos exclusivos para cada tipo de célula37,38. Isso garante a transferência de DNA diretamente para o núcleo da célula39, permitindo a incorporação do DNA de maneira independente do ciclo celular. Consequentemente, a nucleofecção surge como uma técnica viável para transfectar células difíceis de transfectar, como NSCs de camundongos 28,40.

Uma limitação deste método é que um mínimo de 2 x 106 células é recomendado e necessário para cada nucleofecção, embora em condições ideais, um número menor de células possa ser usado por nucleofecção única (ou seja, 5 × 105 células). Outra desvantagem do método é que a qualidade e a concentração do DNA usado para a nucleofecção influenciam significativamente a eficiência da transferência de genes. A utilização de DNA preparado livre de endotoxinas é altamente recomendada para prevenir a mortalidade celular elevada devido à presença de endotoxinas. Além disso, o uso de mais de 6 μg de DNA total para nucleofecção pode reduzir substancialmente a eficiência da transferência de genes e a viabilidade celular. Finalmente, a administração de pulso elétrico também é crítica para a sobrevivência das células nucleofectadas.

Neste trabalho, exemplificamos a manipulação da expressão do gene Snrpn empregando uma estratégia envolvendo a regulação negativa de sua expressão usando plasmídeos epissómicos. Esses plasmídeos não são integrados ao genoma das células e, como os NSCs continuam proliferando in vitro, o DNA introduzido será posteriormente diluído ao longo da divisão celular e, assim, perderá o efeito da manipulação genética. Portanto, essa estratégia é valiosa para estudar o efeito de uma alteração aguda em um curto período ou para células de nascimento in vitro. Algumas alternativas para avaliar um efeito mais prolongado da perturbação gênica estão disponíveis. Por exemplo, um sistema integrativo como o piggyBAC baseado em transposon pode ser usado. Este sistema consiste em introduzir a sequência codificante desejada contida no plasmídeo ladeado por sequências transponíveis e co-nucleofectar as células com um plasmídeo contendo a sequência da enzima transposase41. Alternativamente, transposons ou os sistemas CRISPR/Cas podem ser usados.

O desenvolvimento de tecnologias de transfecção será um passo importante para ensaios de alto rendimento para avaliar o papel de diferentes genes na fisiologia das células-tronco neurais adultas. Em combinação com métodos de purificação e expansão cada vez mais sofisticados, esses estudos permitirão a compreensão da biologia in vitro de NSCs adultos e a comparação das diferenças biológicas entre neuroesferas flutuantes e NSCs in vivo.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por doações do Ministerio de Ciencia e Innovación e da Agencia Estatal de Investigación (MCIN/AEI) (PID2019-110045GB-I00; PID2022-142734OB-I00 e EUR2023-143479) para SRF. EJV (FPU20/00795) e DSL (FPU22/03797) são financiados pelo programa de bolsas espanhol Formación de Profesorado Universitario (FPU). LLC (PRE2020-094137) e JDM (PREP2022-000680) são financiados pelo programa de bolsas Spanish Formación de Personal Investigador (FPI). A CMM (CIACIF/2022/366) é financiada pela Generalitat Valenciana. MIL (CPI-22-481) é financiado pela bolsa do Programa INVESTIGO (Next Generation EU). Financiamento de acesso aberto fornecido pelo Ministério de Ciência e Inovação.

Materials

0.22 μm pore-filter bottles (250 mL) VWR 514-0330P
0.22 μm pore-filter bottles (500 mL) VWR 514-0332P
12-well plate LabClinics PLC30012
15 mL tube Fisher 10738771
24-well plate LabClinics PLC30024
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) BioWest L0180-100
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma D9542
48-well plate ThermoFisher 150687
6-well plate LabClinics PLC30006
96-well plate Labclinics PLC30096
Accutase solution Sigma A6964-100ML Referred as enzymatic solution
Amaxa Mouse Neural Stem Cell Nucleofector Kit Lonza VPG-1004
Amaxa Nucleofector Iib Lonza 10700807
Antibiotic/Antimitotic (A/A) Sigma A5955
Apo-t-Transferrine Sigma T2252-1G
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Sigma F0291
Blasticidin Sigma 203350
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma B4287-25MG
Cell strainer 40 μm LabClinics PLC93040
Deoxynucleotide triphosphate (dNTPs) NZYTech MB08701
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418
Dulbecco’s Phosphate Saline Buffer (DPBS) Gibco 14080-055
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) F12 1:1 Gibco 11320-074
E. coli DH5α Competent Cells ThermoFisher EC0112
Earles's Balanced Salt Solution (EBSS) Gibco 24010-043
Epidermal Growth Factor – Human recombinant (EGF) Gibco 53003-018
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E-6511
Fine Forceps Fine Science Tools 11274-20
Fine Scissors Sharp Fine Science Tools 14060-09
Glucose Sigma G-7021
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase Promega M7805 Kit includes reagents for PCR
Heparin Sigma H-3149
Insuline Sigma I6634
LB agar (Lennox) LabKem AGLB-00P-500
LB broth (Lennox) LabKem LBBR-00P-500
L-Cysteine Sigma C-8277
L-Glutamine Gibco 25030-024
Neubauer chamber Blaubrand BR718620
Nuclease free water Labbox WATR-00A-10K
NZYMaxiprep Endotoxin Free Kit NZYTech MB39901
Papain Lyophilized Worthington LS003119
Progesterone Sigma P-6149
Putrescine Sigma P-7505
Scalpel Fine Science Tools 10316-14
shSCRAMBLE Mission (Sigma) SHC003
shSNRPN Mission (Sigma) TRCN0000109285
Sodium Selenite Sigma S-9133
Spatula Fine Science Tools 10090-17
Sterile PES Syringe Filters (0.22 μm pore-filter) Epica SFPE-22E-050
T12.5 cm2 Flask Biofil TCF012025
T25 cm2 Flask LabClinics PLC70025
T75 cm2 Flask LabClinics PLC70075
Tweezers Fine Science Tools 91150-20
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Referencias

  1. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
  2. Ming, G., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Ann Rev Neurosci. 28 (1), 223-250 (2005).
  3. Doetsch, F., Caillé, I., Lim, D. A., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97 (6), 703-716 (1999).
  4. Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
  5. Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proc Natl Acad Sci. 96 (20), 11619-11624 (1999).
  6. Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Cellular composition and three-dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain. J Neurosci. 17 (13), 5046-5061 (1997).
  7. Mamber, C., Kozareva, D. A., Kamphuis, W., Hol, E. M. Shades of gray: The delineation of marker expression within the adult rodent subventricular zone. Prog Neurobiol. 111, 1-16 (2013).
  8. Cebrian-Silla, A., et al. Single-cell analysis of the ventricular-subventricular zone reveals signatures of dorsal and ventral adult neurogenesis. eLife. 10, e67436 (2021).
  9. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  10. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), e2393 (2010).
  11. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
  12. Ferrón, S. R., et al. Postnatal loss of Dlk1 imprinting in stem cells and niche astrocytes regulates neurogenesis. Nature. 475 (7356), 381-385 (2011).
  13. Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: A review of the neurosphere assay. Anat Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
  14. Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), 156059 (2019).
  15. Ferrón, S. R., et al. A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells. Nat Prot. 2 (4), 849-859 (2007).
  16. Ferron, S., et al. Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells. Development. 131 (16), 4059-4070 (2004).
  17. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Meth. 3 (10), 801-806 (2006).
  18. Santa-Olalla, J., Baizabal, J., Fregoso, M., Cárdenas, M. D. C., Covarrubias, L. The in vivo positional identity gene expression code is not preserved in neural stem cells grown in culture. Eur J Neurosci. 18 (5), 1073-1084 (2003).
  19. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: A critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
  20. Wan, F., et al. The utility and limitations of neurosphere assay, CD133 immunophenotyping and side population assay in Glioma stem cell research. Brain Pathol. 20 (5), 877-889 (2010).
  21. Deleyrolle, L. P., Rietze, R. L., Reynolds, B. A. The neurosphere assay, a method under scrutiny. Acta Neuropsych. 20 (1), 2-8 (2008).
  22. Campos, L. S. Neurospheres: Insights into neural stem cell biology. Neurosci Res. 78 (6), 761-769 (2004).
  23. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres—re-evaluating the relationship. Nat Meth. 2 (5), 333-336 (2005).
  24. Parker, M. A. Expression profile of an operationally-defined neural stem cell clone. Exp Neurol. 194 (2), 320-332 (2005).
  25. Belenguer, G., et al. Adult neural stem cells are alerted by systemic inflammation through TNF-α receptor signaling. Cell Stem Cell. 28 (2), 285-299 (2021).
  26. Cruz, M. T. G., Simões, S., Lima, M. C. P. de Improving lipoplex-mediated gene transfer into C6 glioma cells and primary neurons. Exp Neurol. 187 (1), 65-75 (2004).
  27. Hagemann, C., et al. High efficiency transfection of glioma cell lines and primary cells for overexpression and RNAi experiments. J Neurosci Meth. 156 (12), 194-202 (2006).
  28. Moritz, S., Lehmann, S., Faissner, A., Holst, A. von An induction gene trap screen in neural stem cells reveals an instructive function of the niche and identifies the splicing regulator Sam68 as a Tenascin-C-regulated target gene. Stem Cells. 26 (9), 2321-2331 (2008).
  29. Montalbán-Loro, R., et al. TET3 prevents terminal differentiation of adult NSCs by a non-catalytic action at Snrpn. Nat Comm. 10 (1), 1726 (2019).
  30. Gritti, A., et al. Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain. J Neurosci. 19 (9), 3287-3297 (1999).
  31. Nieto-Estévez, V., Pignatelli, J., Araúzo-Bravo, M. J., Hurtado-Chong, A., Vicario-Abejón, C. A global transcriptome analysis reveals molecular hallmarks of neural stem cell death, survival, and differentiation in response to partial FGF-2 and EGF deprivation. PLoS One. 8 (1), 53594 (2013).
  32. Vergaño-Vera, E., Méndez-Gómez, H. R., Hurtado-Chong, A., Cigudosa, J. C., Vicario-Abejón, C. Fibroblast growth factor-2 increases the expression of neurogenic genes and promotes the migration and differentiation of neurons derived from transplanted neural stem/progenitor cells. Neurociencias. 162 (1), 39-54 (2009).
  33. Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron. 40 (3), 485-499 (2003).
  34. Hack, M. A., Sugimori, M., Lundberg, C., Nakafuku, M., Götz, M. Regionalization and fate specification in neurospheres: the role of Olig2 and Pax6. Mol Cell Neurosci. 25 (4), 664-678 (2004).
  35. Bithell, A., Finch, S. E., Hornby, M. F., Williams, B. P. Fibroblast growth factor 2 maintains the neurogenic capacity of embryonic neural progenitor cells in vitro but changes their neuronal subtype specification. Stem Cells. 26 (6), 1565-1574 (2008).
  36. Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proc Natl Acad Sci. 106 (15), 6387-6392 (2009).
  37. Kobayashi, N., et al. Gene delivery to embryonic stem cells. Birth Def Res C. 75 (1), 10-18 (2005).
  38. Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Meth Mol Biol. 801, 65-74 (2011).
  39. Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J Immunol Meth. 284 (1-2), 133-140 (2004).
  40. von Holst, A., Egbers, U., Prochiantz, A., Faissner, A. Neural stem/progenitor cells express 20 tenascin C isoforms that are differentially regulated by Pax6. J Biol Chem. 282 (12), 9172-9181 (2007).
  41. Woodard, L. E., Wilson, M. H. piggyBac-ing models and new therapeutic strategies. Trend Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).

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Jiménez-Villalba, E., Lázaro-Carot, L., Mateos-Martínez, C. M., Díaz-Moncho, J., Samper-Llavador, D., Igual-López, M., Planells, J., Ferrón, S. R. Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone. J. Vis. Exp. (208), e66651, doi:10.3791/66651 (2024).
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