El presente estudio informa de un protocolo más fácil, económico y que ahorra tiempo para aislar y cultivar de manera eficiente células epiteliales mamarias humanas primarias (HMEC) a partir de pequeñas cantidades de tejido mamario. Este protocolo es adecuado para producir rápidamente HMEC primarios tanto para aplicaciones de laboratorio como clínicas.
La glándula mamaria es una estructura fundamental de la mama y desempeña un papel esencial en la reproducción. Las células epiteliales mamarias humanas (HMEC), que son las células de origen del cáncer de mama y otras enfermedades inflamatorias relacionadas con la mama, han atraído una atención considerable. Sin embargo, el aislamiento y cultivo de HMECs primarias in vitro con fines de investigación ha sido un desafío debido a su naturaleza altamente diferenciada y queratinizada y su corta vida útil. Por lo tanto, el desarrollo de un método simple y eficiente para aislar y cultivar HMEC es de gran valor científico para el estudio de la biología mamaria y las enfermedades relacionadas con la mama. En este estudio, aislamos con éxito HMECs primarias de pequeñas cantidades de tejido mamario por digestión con una mezcla de enzimas combinada con un cultivo inicial en suero fetal bovino-DMEM al 5% que contenía el inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK) Y-27632, seguido de la expansión del cultivo en medio de queratinocitos libre de suero. Este enfoque promueve selectivamente el crecimiento de las células epiteliales, lo que resulta en un rendimiento celular optimizado. La simplicidad y conveniencia de este método lo hacen adecuado tanto para la investigación de laboratorio como para la clínica, que debería proporcionar información valiosa sobre estas importantes áreas de estudio.
El cáncer de mama es el principal tipo de cáncer diagnosticado en mujeres a nivel mundial y es la principal causa de muerte por cáncer1. La patogenia del cáncer de mama es compleja e involucra múltiples factores como la genética, el medio ambiente y el estilo de vida. Las HMEC, células activas productoras de leche, son uno de los componentes más importantes del tejido mamario y probablemente son las células originales involucradas en la carcinogénesis del cáncer de mama. Por lo tanto, las HMEC han recibido la mayor atención de los investigadores para el estudio del cáncer de mama2. Además, las células primarias tienen la capacidad de proporcionar una caracterización biológicamente relevante de procesos celulares complejos debido a que conservan estabilidad genética, morfología normal y un conjunto más completo de funciones celulares básicas que no se pueden lograr con líneas celulares inmortalizadas3. Por lo tanto, el aislamiento y cultivo de las HMEC primarias es un paso esencial para el estudio de la mayoría de las enfermedades relacionadas con la mama, como el cáncer de mama y las enfermedades inflamatorias mamarias.
En la actualidad, se ha establecido un sistema estable y reproducible para el aislamiento, cultivo e identificación de células epiteliales mamarias de ratas, vacas, cerdos y cabras 4,5,6,7. Sin embargo, el aislamiento y el cultivo de HMEC primarios son un desafío debido al microambiente complejo y al bajo rendimiento de las células. Durante décadas, los científicos han estado buscando el método más eficaz para aislar y cultivar HMEC, aunque hace casi 20 años se estableció un sistema de cultivo para HMEC. Por ejemplo, Hammond et al. desarrollaron un medio de cultivo sin suero en el que las HMECs crecieron eficientemente8. Recientemente, Zubeldia-Plazaola et al. probaron cuatro métodos de aislamiento diferentes utilizando procedimientos de digestión enzimática rápida/lenta combinados con filtración secuencial o pasos de centrifugación diferencial para obtener HMECs9. Descubrieron que el método de digestión lenta, junto con la centrifugación diferencial, es el método más eficiente para aislar las HMEC del tejido mamario fresco. Sin embargo, ese método de aislamiento requiere grandes trozos de tejido (40-75 g) y utiliza mayores cantidades de enzimas digestivas. Su procedimiento es complicado (al menos tres centrifugaciones diferentes para obtener diferentes fracciones celulares), además de lento. Por lo tanto, todavía se necesita un método simple y rápido para obtener de manera eficiente poblaciones de HMEC a partir de pequeñas cantidades de tejido mamario para aplicaciones clínicas y de investigación9.
Nuestros estudios previos demostraron que la adición del inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK) Y-27632 en el medio de cultivo inicial puede simplificar el proceso de aislamiento de células epidérmicas de piel humana10, que también se ha utilizado con éxito para el aislamiento de células epiteliales gingivales11. Además, investigaciones previas realizadas por el grupo de Zubeldia-Plazaola y el grupo de Jin han indicado que Y-27632 tiene la capacidad de estimular el crecimiento in vitro rápido e ilimitado de células epiteliales primarias derivadas del tejido mamario 9,12. El presente estudio tuvo como objetivo probar si el uso de Y-27632 simplificaría el aislamiento y el cultivo de HMEC y establecimos con éxito un método simple y fácil de realizar para aislar HMEC de pequeños trozos (1 g) de tejido mamario.
Las HMEC son vitales para preservar la integridad anatómica y funcional del tejido mamario y son útiles en investigaciones científicas, implementaciones clínicas y dominios asociados15. Las células epiteliales primarias son un tipo de células especializadas que tienen pasajes limitados y vidas más cortas. Sin embargo, el crecimiento de las HMEC se ha visto obstaculizado por limitaciones técnicas, que en consecuencia han obstaculizado los avances en la investigación sobre el cáncer de mam…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa de Ciencia y Tecnología de MTC de la provincia de Zhejiang, China (2017ZA055; 2018ZA036), y el Proyecto de Ciencia y Tecnología de Zunyi, provincia de Guizhou, China (Zunyi City Kehe Support NS (2020) No. 18) a X. Xu. Los autores agradecen al Laboratorio de Biología Molecular de la Compañía de Tecnología Biomédica de Youjia (Hangzhou) por proporcionar capacitación en cultivos celulares.
0.05% Trypsin | Basalmedia | K431010 | For HMECs dissociation |
1.5 mL microcentrifuge Tubes | NEST | 081722CK01 | For cell digestion |
100 µm mesh filter | Solarbio | 431752 | For HMECs filtration |
100 mm Cell Culture Dish | Corning | 430167 | For cell culture |
4% paraformaldehyde | solarbio | P1110-100ml | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs |
50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430829 | For cell centrifugation |
Cell Strainer | Solarbio | 431752 | Cell filtration |
Centrifuge | Eppendorf | 5404HN133048 | Cell centrifuge |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | 42820906 | For cell incubation |
Collagenase Type I | Merck | SKU:SCR103 | For HMECs isolation |
Dispase | Solarbio | CAS:42613-33-2 | For HMECs isolation |
DMEM | Gibco | 8122622 | Component of neutralization medium |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 2556132P | Component of neutralization medium |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
Phosphate buffered solution | Tecono | 20201033 | Washing solution |
rabbit anti CK7 | abcam | ab68459 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs |
rabbit anti GATA3 | abcam | ab199428 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs |
Y-27632 | Solarbio | IY0040 | ROCK inhibitor |