Summary

Aislamiento y cultivo de células epiteliales mamarias humanas primarias

Published: May 03, 2024
doi:

Summary

El presente estudio informa de un protocolo más fácil, económico y que ahorra tiempo para aislar y cultivar de manera eficiente células epiteliales mamarias humanas primarias (HMEC) a partir de pequeñas cantidades de tejido mamario. Este protocolo es adecuado para producir rápidamente HMEC primarios tanto para aplicaciones de laboratorio como clínicas.

Abstract

La glándula mamaria es una estructura fundamental de la mama y desempeña un papel esencial en la reproducción. Las células epiteliales mamarias humanas (HMEC), que son las células de origen del cáncer de mama y otras enfermedades inflamatorias relacionadas con la mama, han atraído una atención considerable. Sin embargo, el aislamiento y cultivo de HMECs primarias in vitro con fines de investigación ha sido un desafío debido a su naturaleza altamente diferenciada y queratinizada y su corta vida útil. Por lo tanto, el desarrollo de un método simple y eficiente para aislar y cultivar HMEC es de gran valor científico para el estudio de la biología mamaria y las enfermedades relacionadas con la mama. En este estudio, aislamos con éxito HMECs primarias de pequeñas cantidades de tejido mamario por digestión con una mezcla de enzimas combinada con un cultivo inicial en suero fetal bovino-DMEM al 5% que contenía el inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK) Y-27632, seguido de la expansión del cultivo en medio de queratinocitos libre de suero. Este enfoque promueve selectivamente el crecimiento de las células epiteliales, lo que resulta en un rendimiento celular optimizado. La simplicidad y conveniencia de este método lo hacen adecuado tanto para la investigación de laboratorio como para la clínica, que debería proporcionar información valiosa sobre estas importantes áreas de estudio.

Introduction

El cáncer de mama es el principal tipo de cáncer diagnosticado en mujeres a nivel mundial y es la principal causa de muerte por cáncer1. La patogenia del cáncer de mama es compleja e involucra múltiples factores como la genética, el medio ambiente y el estilo de vida. Las HMEC, células activas productoras de leche, son uno de los componentes más importantes del tejido mamario y probablemente son las células originales involucradas en la carcinogénesis del cáncer de mama. Por lo tanto, las HMEC han recibido la mayor atención de los investigadores para el estudio del cáncer de mama2. Además, las células primarias tienen la capacidad de proporcionar una caracterización biológicamente relevante de procesos celulares complejos debido a que conservan estabilidad genética, morfología normal y un conjunto más completo de funciones celulares básicas que no se pueden lograr con líneas celulares inmortalizadas3. Por lo tanto, el aislamiento y cultivo de las HMEC primarias es un paso esencial para el estudio de la mayoría de las enfermedades relacionadas con la mama, como el cáncer de mama y las enfermedades inflamatorias mamarias.

En la actualidad, se ha establecido un sistema estable y reproducible para el aislamiento, cultivo e identificación de células epiteliales mamarias de ratas, vacas, cerdos y cabras 4,5,6,7. Sin embargo, el aislamiento y el cultivo de HMEC primarios son un desafío debido al microambiente complejo y al bajo rendimiento de las células. Durante décadas, los científicos han estado buscando el método más eficaz para aislar y cultivar HMEC, aunque hace casi 20 años se estableció un sistema de cultivo para HMEC. Por ejemplo, Hammond et al. desarrollaron un medio de cultivo sin suero en el que las HMECs crecieron eficientemente8. Recientemente, Zubeldia-Plazaola et al. probaron cuatro métodos de aislamiento diferentes utilizando procedimientos de digestión enzimática rápida/lenta combinados con filtración secuencial o pasos de centrifugación diferencial para obtener HMECs9. Descubrieron que el método de digestión lenta, junto con la centrifugación diferencial, es el método más eficiente para aislar las HMEC del tejido mamario fresco. Sin embargo, ese método de aislamiento requiere grandes trozos de tejido (40-75 g) y utiliza mayores cantidades de enzimas digestivas. Su procedimiento es complicado (al menos tres centrifugaciones diferentes para obtener diferentes fracciones celulares), además de lento. Por lo tanto, todavía se necesita un método simple y rápido para obtener de manera eficiente poblaciones de HMEC a partir de pequeñas cantidades de tejido mamario para aplicaciones clínicas y de investigación9.

Nuestros estudios previos demostraron que la adición del inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK) Y-27632 en el medio de cultivo inicial puede simplificar el proceso de aislamiento de células epidérmicas de piel humana10, que también se ha utilizado con éxito para el aislamiento de células epiteliales gingivales11. Además, investigaciones previas realizadas por el grupo de Zubeldia-Plazaola y el grupo de Jin han indicado que Y-27632 tiene la capacidad de estimular el crecimiento in vitro rápido e ilimitado de células epiteliales primarias derivadas del tejido mamario 9,12. El presente estudio tuvo como objetivo probar si el uso de Y-27632 simplificaría el aislamiento y el cultivo de HMEC y establecimos con éxito un método simple y fácil de realizar para aislar HMEC de pequeños trozos (1 g) de tejido mamario.

Protocol

Los tejidos mamarios normales frescos utilizados en este protocolo se recolectan de la cirugía alrededor de la lesión de mastitis lobulillar granulomatosa refractaria en el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica China de Zhejiang de acuerdo con las pautas del Comité de Ética Médica del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica China de Zhejiang (Protocolo No. ChiMCTR2100005281, Fecha: 2017-07-17). 1. Adquisición de tejido Recoja tejidos mamarios frescos de muestras quirúrgicas tomadas de mujeres adultas en tubos estériles que contengan 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 3% de penicilina/estreptomicina (P/S).NOTA: Los tejidos mamarios deben manipularse de acuerdo con los siguientes detalles dentro de las 24 horas posteriores a la recolección de la cirugía. 2. Pretratamiento de los tejidos Retire el tejido adiposo del tejido mamario con dos pares de pinzas, asegurándose de que el tejido mamario restante tenga ~ 1 g de peso. Enjuagar el tejido mamario en una solución de etanol al 75% (5 mL) durante 5 s y luego lavar con 20 mL de solución de lavado (Tabla 1) durante 2 x 5 min. 3. Digestión de los tejidos Cortar el tejido mamario en fragmentos más pequeños, triturando el tejido con dos cuchillas quirúrgicas durante 15 min para obtener el tejido homogeneizado. Transfiera las piezas de tejido a un tubo centrífugo de 50 ml. Añadir 10 mL de 5,0 mg/mL de dispasa + 5,0 mg/mL de solución de colagenasa, 3 mL de tripsina al 0,25% y 7 mL de PBS a un total de 20 mL de solución de digestión en un tubo centrífugo de 50 mL que contiene los fragmentos de tejido mamario. Colocar el tubo en un baño de agua a 37 °C e incubar durante 1,5 h; Agite el tubo cada 20 min. Detenga el proceso de digestión inyectando 20 mL de la solución neutralizante. Mezcle el contenido pipeteando ~ 15x. Filtre la mezcla a través de un filtro de malla de 100 μm. Centrifugar a 156 × g durante 5 min. Retirar el sobrenadante y repetir la incubación del pellet con 20 mL de solución neutralizante. Mezclar el contenido pipeteando 15x y centrifugar a 156 × g durante 5 min. Retirar el sobrenadante con cuidado y resuspender el pellet celular con 10 mL de medio de cultivo inicial. Coloque la suspensión celular en una placa de cultivo celular de 100 mm. Cultivar las células en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C. Reemplace el medio de cultivo original con medio de células epiteliales frescas cada tres días. Revise las celdas y actualice el medio cada 2 días. 4. Paso de celdas Retire la placa de 100 mm de la incubadora cuando las células alcancen el 80%-90% de confluencia, deseche el medio usado y enjuague la placa 2 veces con 2 ml de PBS. Retire el PBS y luego agregue 2 ml de tripsina al 0,05% en cada plato de 100 mm.NOTA: Gire el plato para asegurarse de que la solución de tripsina tenga suficiente contacto con el fondo del plato. Coloque el plato de 100 mm en una incubadora a 37 °C durante ~7 min para el proceso de digestión. Examine las células con un microscopio utilizando un objetivo de 40x para asegurarse de que la mayoría de las células se hayan disociado del fondo de la placa. Detenga el proceso de digestión agregando 8 mL de solución neutralizante y transfiera las células a un tubo de 15 mL. Mezcle las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10-15 veces. Centrifugar las células a 156 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante con cuidado, vuelva a suspender las células con 10 ml de medio celular epitelial y cuente el número de células. Añadir 1 × 106 células en 10 mL de medio de células epiteliales en una placa de 100 mm. Refresque el medio celular epitelial y observe las células cada 2 días. 5. Criopreservación celular Repita los pasos 4.1-4.4. Retire el sobrenadante con cuidado y vuelva a suspender las células en 2 ml de solución de criopreservación celular. Transfiera 1 mL de la solución de criopreservación que contiene las células a cada vial criogénico. Registre los nombres de las células criopreservadas, los números de paso y las fechas. Coloque los viales en un recipiente de congelación de velocidad controlada a -80 °C durante la noche. Retire los viales criogénicos del congelador a -80 °C y transfiéralos rápidamente a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.

Representative Results

En la figura 1 se muestra un esquema del procedimiento. El protocolo implica el uso de una combinación de enzimas, a saber, dispasa, colagenasa y tripsina. Esta combinación se utiliza con el propósito de separar la lámina epitelial de la capa de fibroblastos debajo de ella y, posteriormente, utilizar tripsina para disociar las células epiteliales mamarias en una suspensión. Además, se promovió eficazmente el crecimiento de las células epiteliales mediante la adición de Y-27632 al m…

Discussion

Las HMEC son vitales para preservar la integridad anatómica y funcional del tejido mamario y son útiles en investigaciones científicas, implementaciones clínicas y dominios asociados15. Las células epiteliales primarias son un tipo de células especializadas que tienen pasajes limitados y vidas más cortas. Sin embargo, el crecimiento de las HMEC se ha visto obstaculizado por limitaciones técnicas, que en consecuencia han obstaculizado los avances en la investigación sobre el cáncer de mam…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa de Ciencia y Tecnología de MTC de la provincia de Zhejiang, China (2017ZA055; 2018ZA036), y el Proyecto de Ciencia y Tecnología de Zunyi, provincia de Guizhou, China (Zunyi City Kehe Support NS (2020) No. 18) a X. Xu. Los autores agradecen al Laboratorio de Biología Molecular de la Compañía de Tecnología Biomédica de Youjia (Hangzhou) por proporcionar capacitación en cultivos celulares.

Materials

0.05% Trypsin Basalmedia K431010 For HMECs  dissociation
1.5 mL microcentrifuge Tubes NEST 081722CK01 For cell digestion
100 µm mesh filter Solarbio 431752 For HMECs filtration
100 mm Cell Culture Dish Corning 430167 For cell culture
4% paraformaldehyde solarbio P1110-100ml For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
50 mL Centrifuge Tube Corning 430829 For cell centrifugation
Cell Strainer Solarbio 431752 Cell filtration
Centrifuge Eppendorf 5404HN133048 Cell centrifuge
CO2 Incubator Thermo Scientific 42820906 For cell incubation
Collagenase Type I Merck SKU:SCR103 For HMECs isolation
Dispase  Solarbio CAS:42613-33-2 For HMECs isolation
DMEM Gibco 8122622 Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum Gibco 2556132P Component of neutralization medium
Penicillin/Streptomycin Thermo Scientific 15140-122 Antibiotics
Phosphate buffered solution Tecono 20201033 Washing solution
rabbit anti CK7 abcam ab68459 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
rabbit anti GATA3 abcam ab199428 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
Y-27632 Solarbio IY0040 ROCK inhibitor

Referencias

  1. Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature). Cancers (Basel). 14 (10), 2569 (2022).
  2. Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: Their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
  3. Faridi, N., et al. Isolation and characterization of the primary epithelial breast cancer cells and the adjacent normal epithelial cells from iranian women’s breast cancer tumors. Cytotechnology. 70 (2), 625-639 (2018).
  4. Tovar, E. A., et al. Dissecting the rat mammary gland: Isolation, characterization, and culture of purified mammary epithelial cells and fibroblasts. Bio Protoc. 10 (22), e3818 (2020).
  5. Jiang, X., Yang, H., Jing, Q., He, X. A "selective secondary tissue attachment" method for isolation and purification of mammary epithelial cells. Acta Histochem. 124 (8), 151972 (2022).
  6. Bernardini, C., et al. Development of a pig mammary epithelial cell culture model as a non-clinical tool for studying epithelial barrier-a contribution from the imi-conception project. Animals (Basel). 11 (7), 2012 (2021).
  7. Zhang, D., et al. Transdifferentiation of goat ear fibroblasts into lactating mammary epithelial cells induced by small molecule compounds. Biochem Biophys Res Commun. 573, 55-61 (2021).
  8. Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. Serum-free growth of human mammary epithelial cells: Rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (17), 5435-5439 (1984).
  9. Zubeldia-Plazaola, A., et al. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).
  10. Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. J Vis Exp. (138), e57784 (2018).
  11. Xie, Z., et al. Isolation and culture of primary human gingival epithelial cells using y-27632. J Vis Exp. (177), e62978 (2021).
  12. Jin, L., et al. Characterization of primary human mammary epithelial cells isolated and propagated by conditional reprogrammed cell culture. Oncotarget. 9 (14), 11503-11514 (2018).
  13. Böcker, W., Hungermann, D., Decker, T. Anatomy of the breast. Pathologe. 30 (1), 6-12 (2009).
  14. Kouros-Mehr, H., Slorach, E. M., Sternlicht, M. D., Werb, Z. Gata-3 maintains the differentiation of the luminal cell fate in the mammary gland. Cell. 127 (5), 1041-1055 (2006).
  15. Wang, X., Reagan, M. R., Kaplan, D. L. Synthetic adipose tissue models for studying mammary gland development and breast tissue engineering. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (3), 365-376 (2010).
  16. Ethier, S. P., Mahacek, M. L., Gullick, W. J., Frank, T. S., Weber, B. L. Differential isolation of normal luminal mammary epithelial cells and breast cancer cells from primary and metastatic sites using selective media. Cancer Res. 53 (3), 627-635 (1993).
  17. Band, V., Sager, R. Distinctive traits of normal and tumor-derived human mammary epithelial cells expressed in a medium that supports long-term growth of both cell types. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (4), 1249-1253 (1989).
  18. Taylor-Papadimitriou, J., Shearer, M., Tilly, R. Some properties of cells cultured from early-lactation human milk. J Natl Cancer Inst. 58 (6), 1563-1571 (1977).
  19. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. J Tissue Eng Regen Med. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
  20. Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C378-C387 (2008).
  21. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., Mcbride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
  22. Ścieżyńska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).
  23. Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. J Invest Dermatol. 93 (2), 287-290 (1989).
  24. Ren, H. J., et al. Primary cultures of mouse small intestinal epithelial cells using the dissociating enzyme type I collagenase and hyaluronidase. Braz J Med Biol Res. 50 (5), e5831 (2017).

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Qian, L., Yan, J., Chen, S., Abbas Karekad, M. M., Wu, Y., Wu, X., Xu, X., Zhang, X. Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (207), e66638, doi:10.3791/66638 (2024).

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