Cultivo de esferoides desmoplásicos tridimensionales de cáncer de páncreas a partir de cocultivo

El mal pronóstico del cáncer de páncreas se asocia a una variedad de razones, entre las que se encuentra la falta de biomarcadores fácilmente detectables que conduzcan a una detección tardía. Otra razón importante es el espeso estroma que rodea el tejido, lo que conduce a una reducción del suministro de sangre. El depósito de grandes cantidades de matriz extracelular (MEC), la interacción célula-célula, células endoteliales, diversas células inmunitarias, pericitos, miofibroblastos en proliferación y población de fibroblastos, y la presencia de células no neoplásicas (que juntas constituyen la reacción desmoplásica)^1, constituyen el estroma espeso responsable de la resistencia a la quimioterapia y a la radioterapia de PDAC². Las células cancerosas y estromales tienen una interacción compleja, dinámica y bidireccional. Aunque algunos elementos atenúan o aceleran la progresión de la enfermedad, la mayoría de los procesos son adaptativos durante el desarrollo del tumor¹. Esto proporciona un entorno rico en factores de crecimiento, factores proangiogénicos, proteasas y moléculas de adhesión. Estos factores promueven la angiogénesis, la proliferación celular, la metástasis y la invasión ^3,4. Juntos, son inmunes y santuarios privilegiados para el tumor, lo que resulta en resistencia a los medicamentos.

La desmoplasia es una mezcla compleja que consta de varias proteínas de la MEC, junto con células inmunitarias y células estrelladas pancreáticas (PSC). Juntos, tienden a formar un andamio para que crezcan las células. Las PSC son uno de los componentes más grandes del compartimento estromal⁵. Su capacidad para producir enzimas como las metaloproteasas de la matriz (MMP), los inhibidores tisulares de las metaloproteasas de la matriz (TIMP) y los fibroblastos asociados al cáncer (CAF)⁶ implican que es probable que desempeñen un papel fundamental en el desarrollo de la reacción desmoplástica. La MEC, los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) y la vasculatura son los aspectos cardinales del PDAC. Entre los CAF, se especula que los miofibroblastos y los CAF inflamatorios están involucrados en la diafonía activa responsable de las propiedades protumorales⁷. Cuanto más extensas son las formaciones fibroblásicas en el tumor, peor pronóstico ^8,9,10.

El cultivo de células monocapa a través de líneas celulares establecidas sigue siendo una herramienta útil para analizar la toxicidad de los fármacos y es un buen punto de partida para los estudios de prueba de concepto y descubrimiento. Sin embargo, las líneas de cultivo celular establecidas carecen de ADN de la línea germinal y de relatividad clínica¹¹. Al crecer en superficies planas, se someten a diferentes criterios de selección in vitro en comparación con cuando forman parte del tumor, se dividen de forma anormal y pierden su fenotipo diferenciado¹². En general, los cultivos unicelulares limitan la heterogeneidad tumoral y, por lo tanto, pierden relevancia clínica. Son incapaces de representar con precisión la complejidad del microambiente del tumor (por ejemplo, la MEC). El cultivo 3D puede replicar más de cerca el complejo microambiente tumoral.

El cultivo 3D se introdujo en la década de 1970 para células sanas y sus contrapartes neoplásicas¹³. Se han utilizado varias técnicas para estudiar la morfología y arquitectura de los tejidos malignos a través de esferoides¹⁴. Los cocultivos con células estromales pueden modelar señales de TME. Se observó una regulación positiva de los marcadores de EMT cuando las células se cocultivaron con células estrelladas¹⁵. Los esferoides PDAC y su interacción con el estroma pueden modelarse mediante el cocultivo con componentes de la MEC. Se ha reportado que el cocultivo específicamente con PSCs produce datos clínicamente relevantes sobre la citotoxicidad de fármacos 16,17,18. Las PSC también ayudan a la resistencia a los medicamentos al evadir la apoptosis y estimular la proliferación de células cancerosas a través de varios factores paracrinos¹⁹ e inducir la transición de EMT. Por lo tanto, se vuelve fundamental incluir las PSC desde una etapa temprana en los criterios utilizados para evaluar el éxito de un medicamento o sistema de administración de medicamentos. La capacidad de la PSC para mejorar la proliferación y apoyar un crecimiento más rápido en combinación, en comparación con las células de cáncer de páncreas solas, también se ha visto in vivo cuando se evaluaron las inyecciones subcutáneas en el flanco de las dos líneas celulares en ratones inmunocomprometidos²⁰.

También es fundamental tener en cuenta la capacidad de un tipo de célula para interactuar con los componentes de la ECM cuando se cultivan esferoides cocultivados. Se ha informado que BxPC-3 y PANC-1 tienen afinidades iguales en la unión al colágeno. Las dos líneas celulares también se unen de manera equivalente a la laminina, aunque ha habido informes de que BxPC-3 se une mejor 21,22,23,24,25. En términos de migración, Stahle et ^al.26 demostraron una motilidad 5 veces más rápida para las células PANC-1 en comparación con BxPC-3. También se informó que las células PANC-1 migran principalmente como células individuales, mientras que las células BxPC-3 migran como una hoja compacta. La elección de las células también afecta al tamaño del tumor²⁵. Se demostró que los tumores BxPC-3 eran más grandes^27,28 que los obtenidos con PANC-1, mientras que un estudio demostró lo contrario²⁹ casos. A pesar de sus diferencias de tamaño y motilidad, se ha informado que ambas células necesitan largos períodos de latencia para formar tumores en ratones. Esta duración puede ser especialmente larga para BxPC-3, oscilando entre 4 semanas y 4 meses²⁵. Sin embargo, también hay literatura en la que las células madre cancerosas BxPC-3²⁸ o BxPC-3³⁰ han formado tumores visibles más rápido, lo que implica que podría observarse una variación en la duración del crecimiento tumoral. Por lo tanto, las duraciones indicadas aquí solo deberían servir como una guía inicial para las tasas de crecimiento tumoral.

Las células BxPC-3 forman esferoides con células sueltas en la superficie y núcleos densos, mientras que las células PANC-1 forman esferoides³¹ porosos pero robustos, así como esferoides compactos. También se ha reportado que las células PANC-1 son menos diferenciadas y más agresivas³². Manteniendo la naturaleza agresiva³² a la vanguardia, combinada con la mayor motilidad de las células PANC-1, la capacidad de formar esferoides compactos y la capacidad de interactuar con los componentes de la MEC, se eligieron las células PANC-1 para los estudios de esferoides.

En los últimos años, el cultivo de esferoides ha tenido mucho éxito al demostrar una ventaja en su relevancia clínica en comparación con los cultivos bidimensionales (2D). Su relevancia se ha aprovechado en el uso de esta técnica como sustituto de los estudios en animales y para comprender mejor la biología de los tumores. La relevancia clínica de los esferoides, especialmente cuando se cocultivan con PSC, ha permitido su uso para estudiar diversas funciones del esferoide, como la rigidez³³, la expresión de TGF-β 34,35,36,37,38, E-cadherina, F-actina 18,34,36,37, α-SMA 34,35,37,³⁸, lactato deshidrogenasa (LDHA)³², HIF-1α^35,39, resistencia a fármacos 16,37,40, migración celular⁴¹, invasión celular³⁷, fibrosis³⁵, resistencia a la radiación⁴², cambios fenotípicos¹⁸, heterogeneidad³⁶, niveles celulares de interacciones³⁹ y demostrar componentes de ECM^37,38,39. Muchos de los protocolos que se utilizaron para obtener los datos descritos se basan en Matrigel, el método de caída colgante, moldes impresos u otros andamios para ayudar a respaldar el crecimiento de esferoides y ECM. Los estudios también suelen implicar el uso de células fibroblásticas no humanas o células estrelladas recién aisladas de los pacientes. Si bien el uso de células estrelladas es fundamental para que los tumores se parezcan a las condiciones in vivo, la variabilidad entre pacientes asociada con las extracciones frescas hace que estos estudios sean difíciles de replicar.

Este protocolo tiene como objetivo demostrar un modelo que sea fácil de desarrollar, reproducible, clínicamente relevante y libre de andamios, confiando así exclusivamente en las capacidades de los cocultivos para generar naturalmente la MEC. Para ello, se optó por un método de cocultivo sencillo que involucra una mezcla de células PANC-1 (debido a su tendencia natural a migrar como células individuales) junto con células estrelladas pancreáticas humanas (HPaSteC), debido a su capacidad para comportarse como células madre y ser altamente resistentes a los medicamentos. Utilizando los estudios de Durymanov et ^al.38como línea base, se estableció el protocolo que se detalla a continuación después de optimizar aún más parámetros como las proporciones de celdas y las duraciones entre cambios de medios. Los esferoides resultantes de este protocolo pueden ser utilizados como sistema modelo para la evaluación de nuevos candidatos a fármacos⁴⁰.

Además, para los usuarios que no están familiarizados con el cultivo de esferoides, puede ser útil el trabajo de Peirsman et ^al.43que analiza el desarrollo de la base de conocimientos MISpheroID. Establece algunas pautas mínimas de información que podrían ayudar a hacer frente a la heterogeneidad entre los protocolos de laboratorio. Aunque con algunas limitaciones, el trabajo demostró que la elección del medio de cultivo, las líneas celulares, el método de formación de esferoides y el tamaño final de los esferoides son fundamentales para determinar las propiedades fenotípicas de los esferoides.