Este protocolo describe todos los procedimientos, desde el cultivo de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano (ADSC) y la recolección de sobrenadante hasta la extracción de vesículas extracelulares (EV) mediante ultracentrifugación.
Las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano (ADSC) pueden promover la regeneración y reconstrucción de diversos tejidos y órganos. Investigaciones recientes sugieren que su función regenerativa puede atribuirse al contacto célula-célula y a los efectos paracrinos de las células. El efecto paracrino es una forma importante para que las células interactúen y transfieran información a distancias cortas, en las que las vesículas extracelulares (VE) desempeñan un papel funcional como portadoras. Existe un potencial significativo para los ADSC EV en medicina regenerativa. Múltiples estudios han informado sobre la efectividad de estos métodos. Actualmente se describen varios métodos para extraer y aislar EV basados en principios como la centrifugación, la precipitación, el tamaño molecular, la afinidad y la microfluídica. La ultracentrifugación se considera el estándar de oro para aislar los vehículos eléctricos. Sin embargo, todavía no existe un protocolo meticuloso para resaltar las precauciones durante la ultracentrifugación. Este estudio presenta la metodología y los pasos cruciales involucrados en el cultivo de ADSC, la recolección de sobrenadante y la ultracentrifugación de EV. Sin embargo, a pesar de que la ultracentrifugación es rentable y no requiere tratamiento adicional, todavía existen algunos inconvenientes inevitables, como una baja tasa de recuperación y la agregación de EV.
La mayoría de las ADSC se derivan del tejido adiposo y se ha demostrado que promueven la regeneración y reconstrucción de varios tejidos y órganos, incluidos el miocardio, el hueso yla piel. Investigaciones recientes sugieren que la función regenerativa de las ADSC puede deberse al contacto intercelular y a los efectos paracrinos de las células2. El efecto paracrino es un medio importante para que las células interactúen y transfieran información a distancias cortas, y esta función se logra a través de vesículas extracelulares (EV).
Los VE son estructuras de membrana de doble capa producidas por células, con un diámetro que oscila entre 40 nm y 160 nm (con un promedio de aproximadamente 100 nm). Afectan a diferentes funciones celulares, como la producción de citoquinas, la proliferación celular, la apoptosis y el metabolismo 3,4. Se han realizado numerosos estudios sobre las funciones de los ADSC EV, incluyendo la promoción de la regeneración ósea, la regeneración del tejido de la mucosa oral, la supervivencia del tejido adiposo después del trasplante de tejido y la reparación de heridas cutáneas 5,6,7,8. El enorme potencial de los ADSC EV en la medicina regenerativa es evidente. Existen varios métodos para extraer y separar los VE del sobrenadante, como las técnicas basadas en la centrifugación, la precipitación, el tamaño molecular, la afinidad y la microfluídica. El método de ultracentrifugación es ampliamente considerado el estándar de oro para aislar los vehículos eléctricos9. El principio fundamental de la ultracentrifugación para la separación de EV se basa en el hecho de que las partículas de la muestra tienen diferentes coeficientes de sedimentación, lo que da lugar a su sedimentación y agregación en distintas capas de separación. Sin embargo, aún no se ha establecido un protocolo detallado que enfatice las precauciones durante la ultracentrifugación.
Por lo tanto, este estudio describe objetivamente la cultura ADSC, la recolección de sobrenadantes y los procedimientos de ultracentrifugación de EV y los puntos clave con un flujo lógico de información y un lenguaje claro y formal. Esto proporciona una referencia valiosa para futuros experimentos.
Durante el proceso experimental formal, varios puntos son cruciales para lograr los mejores resultados experimentales. Basándonos en nuestra experiencia previa, se recomienda optar por los ADSC de paso 3-6, ya que garantizan el mejor estado celular posible. Antes de P3, es posible que los glóbulos rojos, las células endoteliales y otras células diversas no se hubieran excluido. Después de P6, las células pueden envejecer gradualmente, lo que puede afectar el estado de las VE secretadas. En segundo lugar, el sobrena…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue parcialmente apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82202473).
Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane | Acros Organics | 4652 | 0.22 μm |
Basal Medium For Cell Culture | OriCell | BHDM-03011 | |
Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells) | OriCell | HUXMD-05002 | |
Inverted Microscope | OLYMPUS | Lx70-S8F2 | |
Low Speed Centrifuge | Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd. | SC-3612 | |
Normocin | InvivoGen | ant-nr-05 | |
Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x) | Solarbio | P1410 |