Tek Yer Fıstığında (Arachis spp.) Aflatoksinlerin ve Stilbenoid Fitoaleksinlerin Tahribatsız SPE-UPLC Tabanlı Miktar Tayini Tohum

1. Mantar mücadelesi için tohumların hazırlanması Aflatoksijenik Aspergillus flavus NRRL 3357’yi bir test tüpünde 30 ° C’de 6 gün boyunca eğimli bir Patates Dekstroz Agar (PDA) üzerinde inkübe edin. Tween 20 (1 L damıtılmış steril suda 100 μL Tween) ile 10 mL su ile test tüpünden mantar sporlarını hasat edin, bir huniye yerleştirilmiş cam yününden süzün ve sporları kullanım kılavuzuna bakarak bir hemositometre ile sayın. Spor süspansiyonunu steril su ile 1.000 spor / μL konsantrasyonuna seyreltin. Konsantrasyonu bir hemositometre ile onaylayın.NOT: Spor süspansiyonunu zorlu deneylerden en geç 2 saat önce hazırlayın. Fıstık kabuklarını yavaşça kırın ve kabuklarını çıkarın. Tohumları, tohum hacmi beher hacminin 1 / 5’ini geçmeyecek şekilde steril bir behere yerleştirin, beher hacminin yaklaşık% 70’ine% 0.05 hidrojen peroksit çözeltisi ekleyin ve tohumların 3 saat boyunca su emmesine izin verin. Hidrojen peroksit çözeltisini tohumlardan boşaltın ve tohumları kaplamak için behere yaklaşık 3 kat daha fazla etanol-su karışımı (h/h) ekleyin. 1 dakika bekletin ve ardından tohumları 2 kez eşit hacimde steril damıtılmış su ile durulayın. Etanol ile sterilize edilmiş tohumlarla behere 5 kat hacimde% 3 hidrojen peroksit ekleyin ve 5 dakika bekletin, ardından sıvıyı boşaltın ve tohumları eşit hacimlerde steril su ile iki kez durulayın (Şekil 2A). Şekil 2: Aflatoksin ve fitoaleksin fraksiyonlarının aşılanması, inkübasyonu ve ekstraksiyonu için yer fıstığı tohumlarının hazırlanması. (A) Emilmiş tohumların %3 hidrojen peroksit ile sterilize edilmesi; (B) tohumlardan testa (deri) çıkarmak; (C) embriyonik eksen parçasının kesilmesi; (D,E) bir matkap ucu ile yarım kotiledonda delme boşluğu; (F) delinmiş tohum parçalarını agar üzerine yerleştirmek; (G) delinmiş boşluğa mantar sporları uygulamak. (H) Kuluçka sonrası tohumlu petri kabı; (I) inkübe edilmiş tek tohumların (kontrol numunelerinin fotoğrafı) güçlendirilmiş boncuk tüplerine yerleştirilmesi; (J) ölçülen hacimde ekstraksiyon çözücüsünün eklenmesi; (K) numunelerin bir boncuk parçalayıcıda toz haline getirilmesi; (L) toz haline getirilmiş bulamacın santrifüjlenmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Tohumları steril bir kağıt havlu üzerine koyun, forseps ile tohum testasını çıkarın ve embriyonik ekseni içeren tohumun yaklaşık 1/3’ünü neşter ile kesin (Şekil 2B,C). Tohumun bu kısmını atın veya büyüme ortamı olan bir test tüpünde bir bitki yetiştirmek için kullanın (Şekil 1B, E). Tohumun kalan kısmını iki kotiledona bölün, bir Petri kabına koyun, tohum parçalarını nemli steril filtre kağıdı ile örtün, dehidrasyonu önlemek için kapağı değiştirin ve hemen aşılama adımına geçin. Zorlu deneyleri gerçekleştirmeden önce, 100 x 15 mm’lik tabaklara 26 mL %1,5 steril agar suya dökerek tohum kuluçka ortamı ile yeterli sayıda Petri kabı hazırlayın ve gece boyunca katılaşmalarına izin verin. Kalan her bir kotiledonun dış tarafının ortasında, tohumu 1,6-2,34 mm çapında steril keskin bir matkap ucu ile manuel olarak delerek 1,5-2 mm derinliğinde bir boşluk açın. Bir boşluk oluşturmak ~ 2-5 s sürer (Şekil 2D, E). 4 ila 6 “delinmiş” tohum parçasını agar ile bir Petri kabına yerleştirin ve 10 μL’lik bir pipetleyici ile her yarım kotiledon parçasının delinmiş boşluğuna 2 μL 1.000 spor/μL süspansiyon uygulayın. Spor süspansiyonu yerine, kontrol tohumlarına steril su uygulayın (Şekil 2F,G). Tüm Petri kaplarını kapaklarla kapatın ve 30 °C’de ışıksız olarak 72 saat inkübe edin. 2. Kuluçkaya yatırılan tohum parçalarından numune alınması ve aflatoksin ve fitoaleksin analizleri için hazırlanması Tohum parçalarını forseps ile agardan çıkararak ve her birini 13 zirkonyum seramik boncuklu (12 tanesi 2,8 mm çapında ve 1 tanesi 6,5 mm çapında) etiketli 7 mL’lik boncuk şişelerine yerleştirerek 72 saatte toplayın (Şekil 2H,I).NOT: Bu noktada, hemen işlenmezse, şişeler -80 °C’lik bir dondurucuya yerleştirilebilir ve daha fazla işlemden önce 2 aya kadar saklanabilir. Fitoaleksinler ve aflatoksinler aynı tohum ekstraktında belirlenir. Ekstraksiyon için, görsel tohum boyutuna (küçük, orta veya büyük) bağlı olarak, boncuk şişelerine 2 veya 4 mL hassas bir şekilde ölçülen metanol-su karışımı (90:10, v/v) ekleyin ve 45 saniye boyunca 5,5 m/sn’de toz haline getirin. Toz haline getirilmiş tohumlu şişeleri bir santrifüje koyun ve 3 dakika boyunca 1.860 × g’da santrifüjleyin (Şekil 2J – L).NOT: Aşağıdaki önemli17,22 stilbenoid türevleri belirlenmiştir (tümü trans-konfigürasyonda): resveratrol, araşidin-1, araşidin-2, araşidin-3, 3′-izopentadienil-3,5,4′-trihidroksistilben (IPD) ve SB-1. Aflatoksin analizleri için, zorlu deneyleri çalıştırmadan önce, aşağıdaki gibi yeterli sayıda temizleme sütunu hazırlayın. Eşleşen bir polietilen gözenekli (20 μL) frit, 90° ‘lik bir açıyla kesilmiş bir cam çubuk yardımıyla 1,5 mL’lik bir polipropilen kolona yerleştirin. 50 mg magnezyum silika jeli (100-200 göz) özel yapım bir kepçe ile sütuna yerleştirin ve sütunu bir cam çubukla aşağı iterek aynı frit ile kapatın (Şekil 3A – E).NOT: Bu miktarda magnezyum silika jel 75 μL hacim kaplar ve adsorban tabakasının yüksekliği 3 mm’dir. Şekil 3: Temizleme kolonlarının ve filtrelerin hazırlanması. (A,B) Gözenekli bir fritin namluya yerleştirilmesi; (C, D) magnezyum silika jel ile doldurma varil; (E) adsorbanı paketlemek ve üst gözenekli bir fritin namluya yerleştirilmesi. (F) Bir Pasteur pipetinin üzerine 11,5 mm çapında bir cam elyaf daire yerleştirin. (G,H) Dairenin merkezini plastik veya tahta bir çubukla Pasteur pipet haznesinin dibine kadar itin ve cam elyafını sıkıca sıkıştırın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Bu noktada, Şekil 3F – H’de gösterildiği gibi eşleşen sayıda ısmarlama filtre hazırlayın. Aflatoksin analizleri için, süpernatantın 0,5 mL’ye kadar alikotunu hassas bir şekilde ölçün (adım 2.2’de açıklandığı gibi elde edilir), bunu özel olarak paketlenmiş mini sütuna aktarın ve ekstraktın yerçekimi ile 4 mL’lik bir cam şişeye akmasına izin verin. 1.0 mL metanol-su (90:10, v/v) karışımını kolona aktarın ve yerçekimi ile safsızlıkları aynı 4 mL şişeye yıkayın (Şekil 4A). Şekil 4: Tohum ekstraktlarının saflaştırılması ve UPLC analizleri için hazırlanması. (A) Paketlenmiş sütunlara sahip raf. (B) Temizleme kolonlarından ayrıştırılmış saflaştırılmış ekstrakt ile altı adet 4 mL’lik şişedenN2 gazı ile buharlaştırıcı çözücü. (C) 4 mL’lik şişelere enjeksiyon çözücüsü (MeOH-H2O 9: 1, v / v) eklenmeden önce ve sonra buzlu köpük kaplarda (1 ve 2) şişelerin ve filtrelerin sıfırın altındaki bir sıcaklığa getirilmesi. (D) Soğutulmuş ekstraktın 4 mL’lik bir şişeden 400 μL’lik bir otomatik örnekleyici şişesine filtrelenmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Kombine elüatları atın. Aflatoksin fraksiyonunu kolondan yerçekimi ile 1.2 mL aseton-asetonitril-su- formik asit (65:31:3.5:0.5, h/h) karışımı ile 4 mL’lik temiz bir cam şişeye boşaltın (Şekil 4A). Alternatif olarak, 2.0 mL asetonitril-su- formik asit (96:3,5:0,5, h/h) karışımı ile kolondan aflatoksinleri elüte edin ve 2 μL’ye kadar elüatın bir alikotunu doğrudan ultra performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) sistemine enjekte edin (çözücününN2 ile buharlaşması olmadan).NOT: Bu durumda, aflatoksinler için 10 kata kadar daha düşük kantitasyon limiti bekleyin; Vakaların çoğunda, bu tür bir hassasiyet düşüşü kabul edilebilir, çünkü zorlu tohumdaki aflatoksin konsantrasyonları genellikle yüksektir. Çözücüyü, 45 ° C’de ısıtılmış bir bloktaN2’lik bir akışta şişelerden çıkarın. Şişeyi kapatın ve bir sonraki adımda eklenen çözücünün buharlaşmasını en aza indirmek için 30-45 saniye boyunca kırılmış buz içeren bir kaba koyun. Özel yapım filtreleri tek kullanımlık test tüplerine yerleştirin ve filtrasyon sırasında solventin buharlaşmasını en aza indirmek için tüpleri başka bir kaptaki buza yerleştirin (Şekil 4B,C). Çözücünün buharlaşmasından sonra, kuru kalıntıyı hassas bir şekilde ölçülen 0.25-1.0 mL metanol-su karışımında (90:10, v/v) çözün ve 1-2 saniye boyunca girdap yapın. Saflaştırılmış ekstraktlar içeren şişeleri UPLC otomatik numune alma cihazına yerleştirin ve UPLC sistemine 0.1 ila 3.0 μL enjekte edin (Şekil 5A,B).NOT: Girdaplamadan sonraki çözeltinin bazı asılı parçacıklara sahip olduğundan şüpheleniliyorsa, çözeltiyi soğutulmuş filtreden süzün (Şekil 4D). Şekil 5: Saflaştırılmış ekstraktların UPLC analizlerinin süreci ve sonuçları. (A) Saflaştırılmış numune ekstraktlarının bulunduğu bir rafın UPLC otomatik numune alma cihazına yerleştirilmesi. (B) Enstrümantal analizlerin yapılması, verilerin elde edilmesi ve sonuçların yorumlanması. (C) Dört ana aflatoksinin UPLC’si; İlgilenilen başlıca zirveler olan aflatoksinler B1 ve B2 sırasıyla 0.04 ve 0.004 ng’yi temsil eder. (D) Aflatoksinler B1 ve B2’nin UPLC’si, tepe 2, 2 pg seviyesinde (8 μL’lik bir akış hücresi ile) aflatoksin B1’i temsil eder. (E) Yabani bir Arachis türü ile yerel bir fıstık tarlasından hasat edilen bir tohumun saflaştırılmış ekstraktının UPLC’si. (F) Bazik bir alüminyum oksit mini kolon ile saflaştırılmış, zorlanmış bir fıstık tohumunun ekstraktının UPLC’si. (G) Bir Florisil sütunu ile saflaştırılmış meydan okunmuş fıstık tohumu ekstraktının UPLC’si; mavi kromatogram, kolondan 1 mL metanol-su (90:10 v/v) karışımı ile yıkanan safsızlıkları sunar; siyah kromatogram, aflatoksinler M1 ve B1’in zirvelerini gösterir. Aflatoksin B1 seviyesi 48 ng / g’dır. (H) Zorlu bir tohumdan elde edilen yer fıstığı stilbenoidlerinin tipik bir kromatogramı; kısaltma: IPD = 3′-izopentadienil-3,5,4’-trihidroksistilben. Not: Tohum ekstraktlarındaki tüm stilbenoidler trans-konfigürasyondadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.  Fitoaleksin analizleri için, her bir boncuk şişesinden 200 μL süpernatanı yukarıdaki Pasteur pipet filtresine aktarın. 2 μL’lik bir UPLC otomatik numune alma cihazı şişesine filtrasyonu hızlandırmak için sıkıştırılmış bir nitrojen tankından N400 gazı kullanın ve şişeyi bir PTFE septumlu uygun bir kapakla kapatın (Şekil 4D). 3. Aflatoksin analizleri Tohum ekstraktlarındaki aflatoksinlerin ayrılması için, bir otomatik numune alma cihazı, bir kuaterner pompa, bir floresan dedektörü, bir UPLC BEH C18 3,0 mm x 100 mm, eşleşen bir ön kolona sahip 1,7 μm kolon ve orijinal uzunluğunun ‘ine kadar kesilmiş 0,25 iç çapa sahip standart örme PTFE bobine sahip bir kolon sonrası fotokimyasal reaktör (PHRED) ile donatılmış bir UPLC sistemi kullanın.NOT: Yazarlar tarafından kullanılan UPLC cihazı ve ilgili ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Aşağıdaki gradyanda su (A), metanol (B) ve asetonitril (C) kullanın: başlangıç koşulları, .7 A, B, .3 C, doğrusal olarak 3.75 dakikada A, B, C olarak değiştirildi, 3.751 dakikada %0 A, .4 B, .6 C olarak değiştirildi, 3.249 dakika izokratik tutuldu, daha sonra 0.01 dakika içinde başlangıç koşullarına değiştirildi ve bir sonraki enjeksiyondan önce 2.499 dakika izokratik tutuldu. Akış hızını 0,45 mL/dk’ya ve çalışma süresini 9,5 dk’ya ayarlayın. Sistem kolon ısıtıcısında kolonu 40 °C’de tutun. Aflatoksinler B1, B2, G 1, G2 ve M1 miktar tayini için uyarma ve emisyon dalga boyları olarak sırasıyla 362 nm ve 440 nm kullanın. Majör aflatoksinlerin yapıları Şekil 6A’da gösterilmiştir.NOT: Deney koşulları altında, A. flavus NRRL 3357 tarafından yalnızca aflatoksinler B1 ve B2’nin üretilmesi beklenmektedir; tohum mücadelesi için bir A. parasiticus suşu kullanılırsa, aflatoksinler B1, B2, G1 ve G2 üretimi beklenir. Yazılım kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi ilgili otantik standartların (kalibrasyon eğrisi) tepe alanlarına atıfta bulunarak aflatoksin konsantrasyonlarını belirleyin.NOT: UPLC prosedürü, floresan dedektörü için yüksek hassasiyet ayarlarında temel gürültü gösterdiğinden, aflatoksinler için Algılama Limiti (LOD) ve Kantitasyon Limiti (LOQ), LOD için 3:1 ve LOQ için 10:1 olan yaygın olarak kabul edilen Sinyal-Gürültü oranı kullanılarak değerlendirilir. Bölüm 2 ve 3’te açıklanan yer fıstığı tohumu analizi için rutin deney düzeneğinde, aflatoksinler G1 ve B1 için kantitasyon sınırlarının, aflatoksinler G2 ve B2 için sırasıyla 0,8 ve 0,08 ng/g’ye eşit veya daha az olması beklenmektedir. 4. Stilbenoid fitoaleksin analizleri Stilbenoidlerin ayrılması için, aşağıdaki gradyanda su (A), metanol (B) ve% 88 formik asit (C) kullanın: başlangıç koşulları,% 53 A,% 42 B,% 5 C,% 35 A,% 60 B,% 5 C olarak değiştirildi 2.0 dakikada, 4 dakika boyunca izokratik tutuldu, 0.5 dakikada% 0 A,% 95 B,% 5 C olarak değiştirildi, 2.5 dakika boyunca izokratik tutuldu, Daha sonra 0.1 dakika içinde başlangıç koşullarına değiştirildi ve bir sonraki enjeksiyondan önce 2.9 dakika boyunca izokratik tutuldu. Akış hızını 0,5 mL/dk’ya ve çalışma süresini 12,0 dk’ya ayarlayın. Stilbenoidlerin konsantrasyonlarını, ilgili otantik standartların tepe alanlarına (kalibrasyon eğrisi) ve/veya yazılım kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi yayınlanmış molar sönme katsayılarına atıfta bulunarak belirleyin. Majör stilben türevi fitoaleksinlerin yapıları Şekil 6B’de gösterilmiştir.NOT: Fitoaleksinlerin ayrılması, aynı sistem kullanılarak, ancak bir floresan dedektörü ve bir PHRED reaktörü olmadan gerçekleştirilir. Bunun yerine, yer fıstığı stilbenoidlerinin tespiti ve miktarının belirlenmesi için bir Diyot Dizi Dedektörü kullanılır. Majör stilbenoid fitoaleksinler için Kantitasyon Limiti (LOQ), stilbenoid konsantrasyonları aynı ekstrakttaki aflatoksin konsantrasyonlarını bazı büyüklük sıralarına göre aştığından pratik bir anlama sahip değildir; 3 günlük inkübasyondan sonra, stilbenoidler güvenilir bir şekilde ölçülür.