Anteriormente se desarrolló un sistema para el análisis automatizado y rápido de glicanos en proteínas. Este artículo presenta el protocolo para el “análisis glicocualitativo”, optimizado para un amplio espectro de usuarios, como los que se dedican al análisis de estructuras de glicanos en biofarmacéuticos y otros materiales glicoconjugados.
La glicosilación de proteínas, una modificación postraduccional crítica, influye en la estabilidad, eficacia e inmunogenicidad de las proteínas recombinantes, incluidos los biofármacos. Las estructuras de glicanos exhiben una heterogeneidad significativa, que varía según los tipos de células de producción, las condiciones de cultivo y los métodos de purificación. En consecuencia, el seguimiento y la evaluación de las estructuras de glicanos de las proteínas recombinantes es vital, especialmente en la producción biofarmacéutica. El microarray de lectinas, una técnica complementaria a la espectrometría de masas, cuenta con una alta sensibilidad y facilidad de uso. Sin embargo, normalmente se necesita más de un día para dar resultados. Para adaptarlo a la investigación no glicocientífica o al desarrollo de procesos de productos farmacéuticos, se necesita una alternativa automatizada y de alto rendimiento. Por lo tanto, se desarrolló el primer sistema de perfilado de glicanos basado en lectina totalmente automatizado del mundo, utilizando el concepto de tecnología de “matriz de perlas en una sola punta (BIST)”. Este sistema permite la preparación y el almacenamiento de perlas inmovilizadas con lectina en unidades de 1.000, con órdenes de inserción paralelas personalizables para diversos fines. Este artículo presenta un protocolo práctico para la investigación con proteínas recombinantes “glico-calificadas”. Después de probar su reactividad frente a 12 conjugados de poliacrilamida-glicano, se seleccionaron 15 lectinas para aumentar la versatilidad del sistema. Además, el proceso de etiquetado de muestras se optimizó cambiando de Cy3 a biotina, lo que redujo el tiempo total de procesamiento en 30 minutos. Para una calificación inmediata de los datos, las señales de unión a lectina se muestran como un código de puntos en el monitor superior. La fiabilidad del sistema se confirmó mediante pruebas de reproducibilidad diarias, pruebas de repetibilidad y pruebas de almacenamiento a largo plazo, con un coeficiente de variación del <10%. Este glicoanalizador rápido y fácil de usar tiene aplicaciones potenciales en el control de calidad de glicoproteínas endógenas para la evaluación y validación de biomarcadores. Este método facilita el análisis para aquellos que se inician en la glicociencia, ampliando así su utilidad práctica.
La glicosilación de proteínas es una modificación postraduccional crucial que debe evaluarse en biofármacos. Los perfiles de glicanos de las proteínas pueden variar en función de las condiciones de cultivo, los procesos de purificación y las células huésped1. Se requieren instrumentos simples para calificar la glicosilación dentro de la tubería de bioprocesos. Se estima que más del 50% de las proteínas secretadas y de membrana in vivo se modifican con múltiples glicanos, que cambian según el linaje celular, la etapa de desarrollo y el estado de la enfermedad, como el inicio de la malignidad2. El seguimiento de los perfiles de glicanos tiene un potencial significativo para identificar marcadores de diagnóstico únicos y dianas farmacológicas. Los instrumentos automatizados capaces de medir rápidamente tamaños de muestra a gran escala tienen una gran demanda para verificar y validar dicha glicosilación aberrante a partir de cientos de muestras de pacientes en proceso de descubrimiento.
La tecnología de microarrays se ha incorporado a la glucómica para evaluar el perfil de glicanos de las glicoproteínas3. En este método, varias lectinas, que son proteínas de unión a glicanos, se inmovilizan en una superficie como un portaobjetos de vidrio. Esta tecnología de glicoanálisis basada en la interacción no requiere la liberación previa de glicanos de las proteínas centrales, lo que simplifica el proceso para los investigadores nuevos en la glicotecnología. A pesar de su uso generalizado, para aplicaciones industriales como la bioproducción, se requería un sistema automatizado capaz de monitorear rápida y fácilmente los glicanos para un mayor número de objetivos de análisis. Para abordar esto, se informó anteriormente de un sistema automatizado de perfiles de glicanos basado en un concepto único denominado “matriz de cuentas en una sola punta” (BIST), desarrollado inicialmente para el genotipado. Este sistema simplifica el proceso con un autoinstrumento de alto rendimiento de tipo cajaúnica 4. Utilizando puntas en las que varias perlas fijadas por lectina están dispuestas en paralelo 4,5, se estableció un método para analizar las estructuras de glicanos modificadas en glicoproteínas, denominado GlycoBIST (en adelante, “sistema automático de perfil de glicanos”) (Figura 1A). Las lectinas se pueden fijar en 1.000 perlas y secar para mantener la actividad durante un año, tanto antes como después de envasarlas en una punta. Una vez que las puntas y los cartuchos que contienen reactivos, como el anticuerpo antiestreptavidina marcado con HPP (SA-HRP), se colocan en el instrumento prototipo de medición (un dispositivo de medición de reacción automatizado, consulte la Tabla de materiales), la punta funciona como una autopipeta. Un escáner de detección de quimioluminiscencia en la parte trasera interior del instrumento cuantifica las señales de ocho puntas simultáneamente. Los datos cuantitativos de estas ocho puntas se muestran de forma compacta y simultánea como códigos de puntos en la pantalla táctil del instrumento para una confirmación rápida de los resultados de la medición. Además, el valor representado como el máximo del pico medido se transporta desde el instrumento como datos brutos, y permite la representación gráfica por parte de investigadores individuales (Figura 1A, panel inferior).
En este artículo, los autores describen un método mejorado de etiquetado de proteínas con biotina, reduciendo el tiempo de procesamiento a 30 minutos. Las proteínas diana se biotinilan con antelación y se detectan mediante SA-HRP (Figura 1B). Se construyó una punta GlycoBIST estándar (punta especializada para el perfilado automático de glicanos) con 15 lectinas seleccionadas para lograr el perfil versátil de glicanos glicoproteínas para la exhaustividad analítica.
En este estudio, se ha desarrollado una técnica de evaluación rápida para la glicosilación que emplea la tecnología de “matriz de perlas en una sola punta”. El presente estudio introdujo una punta estándar de GlycoMIST, diseñada tanto para investigadores de glicociencia como para investigadores no glicocientíficos, para facilitar la evaluación rutinaria y completa de la glicosilación. El microarray de lectinas, que normalmente emplea entre 20 y 100 lectinas 12,13, se ha utilizado ampliamente en las evaluaciones. Sin embargo, teniendo en cuenta las especificidades superpuestas de algunas lectinas en el microarray y la variedad relativamente limitada de glicoformas en una glicoproteína objetivo en comparación con los glucómicos de muestras clínicas crudas, se anticipó que 15 lectinas serían suficientes para una evaluación simplificada del perfil de glicanos focalizados.
El paso crítico en el protocolo es permitir que las perlas inmovilizadas con lectina o las puntas llenas de esas perlas vuelvan a la temperatura ambiente después del almacenamiento antes de usarlas para mediciones. En particular, se observó que la condensación debilita las señales; Por lo tanto, se recomienda nunca abrir la bolsa de almacenamiento hasta que vuelva a la temperatura ambiente. Para el almacenamiento de reactivos de biotinilación, también es esencial secar completamente antes del almacenamiento. Un proceso de secado insuficiente disminuye la eficiencia de la biotinilación a proteína debido a la hidrólisis del reactivo de biotinilación14.
En cuanto a las modificaciones y la resolución de problemas, se exploró un método para reducir la variabilidad, especialmente en lo que respecta al método de medición en el dispositivo automatizado de medición de reacciones. En particular, cuando el volumen de tampón en el depósito utilizado para el análisis es de 150 μL, las burbujas entran en la punta, lo que reduce la eficiencia de la reacción y da lugar a una gran variación en los valores. Por lo tanto, se recomienda colocar al menos 200 μL de tampón en el depósito.
La cantidad de líquido que llena las puntas durante el pipeteo automático también es un factor importante. Las puntas no pueden expulsar completamente el líquido a medida que pasa al siguiente paso de reacción. Por lo tanto, en una cantidad no pequeña, el tampón del paso anterior se transfiere al siguiente paso, y el tampón anterior permanece en el área superior de la solución insertada cuando se aspira el nuevo tampón. Por lo tanto, el sustrato y otras soluciones deben aspirarse lo suficiente como para llenar el depósito superior (ver Figura 1A). Dada la irreversibilidad de las reacciones de anticuerpos en el instrumento, es crucial tener precaución y evitar errores durante la configuración inicial.
Una limitación del método es que se restringe a proteínas solubles derivadas de suero y sobrenadantes de cultivo. En el método actual, la lectina no está reticulada covalentemente a la perla, lo que la hace incapaz de analizar muestras que contienen altas concentraciones de tensioactivos, como extractos de células y tejidos. En consecuencia, son necesarias mejoras futuras para abordar estas limitaciones.
La importancia de la matriz de perlas de lectina radica en la intercambiabilidad y expansión de las especies de lectina fijadas en las perlas. Por ejemplo, en el análisis diferencial a gran escala (>1.000 muestras) utilizando el sistema automatizado de perfiles de glicanos, los usuarios pueden adaptar una línea de 15 lectinas en la punta basándose en el perfil preliminar de glicanos basado en micromatrices de lectinas de la glicoproteína objetivo (<100 muestras). Además, la alta estabilidad de las perlas fijadas con lectina permite la experimentación inmediata desde el diseño inicial de la punta hasta la medición con procedimientos rutinarios. No solo las 25 de las 28 lectinas que han demostrado una alta fiabilidad (Tabla 1), sino también las lectinas de interés para el usuario pueden utilizarse para crear un sistema de perfilado de glicanos automatizado personalizado para sus experimentos específicos, siguiendo la prueba de fiabilidad rutinaria antes mencionada. Este enfoque condujo al diseño de una posible matriz de perlas de 120 lectinas de ocho tipos diferentes de puntas para la medición ampliada junto con el sistema estándar de perfiles de glicanos.
Un estudio previo se centró en establecer un procedimiento de detección de glicoproteínas marcadas con Cy3 en línea con el microarray de lectinas15. Este método se limitó a 13 lectinas en paralelo en la punta debido a la interferencia de fluorescencia. El método actual, que utiliza etiquetas de detección de HRP, tiene capacidad para 15 perlas fijadas con lectina y dos perlas de control (positiva y negativa) en una punta. Además, la biotinilación de las muestras ha acortado el proceso de análisis.
Este método analítico se puede aplicar no solo a la investigación académica, sino también a la investigación médica y farmacéutica, alimentos, cosméticos y otros campos industriales. Si bien las tecnologías de microarrays de lectinas y glicoproteómica están bien establecidas, el enfoque de este estudio sigue siendo significativo por su automatización total y su capacidad para un análisis rápido con menos pasos. En el futuro, se realizarán mejoras en este análisis a un método cuantitativo mediante la normalización de la señal utilizando ciertas glicoproteínas, empleando perlas fijadas en anticuerpos junto con perlas fijadas en lectina en una punta.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Transferencia de Tecnología Adaptable y sin Costuras a través de la Investigación y Desarrollo Impulsados por Objetivos (A-STEP), financiado por la Agencia de Ciencia y Tecnología de Japón (JST), bajo la Subvención Número JPMJTR204A y en parte por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) KAKENHI Subvención Número 23H02680 a AK. Nos gustaría agradecer a Editage (www.editage.jp) por editar el idioma inglés.
0.2 mL 8 PCR tubes + flat cap | FastGene | FG-0028FC/SE | For dispensing and storage of biotin labeling reagents |
2.0 mL SC Micro Tube protein LB | SARSTEDT AG&Co. KG | 72.694.600 | For loading samples in LuBEA-VIII |
Analysis software | SAS Institute Inc. | JMP 17 | |
Anti-Static Ionizer. 110 volts | Plas-Labs | 800-AS/SPI | Use while inserting beads into BIST Tip. |
Antistatic tweezers NK2A | RUBIS | 9-5681-01 | Use while inserting beads into BIST Tip. |
Automated reaction measurement device | Precision System Science Co., Ltd. | LuBEA | All data in this study were obtained using LuBEA-VIII. While LuBEA is commercialized, LuBEA-VIII is currently in the development phase. The website for product details of LuBEA and LuBEA-VIII can be found at the following URL (https://www.pss.co.jp/english/technology/apit/bist02.html). |
Biotin-(AC5)2 Sulfo-Osu | Dojindo | 341-06801 | As biotinilation reagent |
BIST spacer bead- V-11 | Precision System Science Co., Ltd. | F4938000 | Diameter: 1 mm |
BIST tip and sheath | Precision System Science Co., Ltd. | F4930-000 | Fill this empty tip with beads. |
Calcium chloride | Wako | 039-00475 | For preparing buffer solutions |
Can Get Signal Solution 2 | TOYOBO | NKB-301 | This blocking reagent is good for this method |
CentriVap Benchtop Vacuum Concentrators | Labconco | 7810010 | For dry of biotinilation reagent. The substitution provided by other companies is possible. |
Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705060 | For measuring the samples by LuVEA VIII |
Cold trap CentriVap series | Labconco | 7460040 | For dry of biotinilation reagent. The substitution provided by other companies is possible. |
Glycine | Wako | 077-00735 | For preparing buffer solutions |
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate | Wako | 139-00722 | For preparing buffer solutions |
Milli-Q reference | MERCK | ZIQ7000T0C | As deionazed water for dilution of reagents and buffers |
PBS | Wako | 162-19321 | For preparing buffer solutions |
Peroxidase Streptavidin | Jackson | 016-030-084 | This antibody is good for GlycoBIST analysis. It is useful for the detection of the western blotting, although substitutions can be provided by other companies. |
Probe bead | Precision System Science Co., Ltd. | FP4936000 | For preparing lectin-fixed beads. See Shimazaki, H. et al., Current Protocols in Protein Science, 2020 in reference section for detail. |
Protein LoBind Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030108442 | Use while preparing the samples such as biotinylation. |
Silica gel (for desiccan) | Kanto chemical | 37039-02 | Use while storing the GlycoBIST tip and dried biotinylation reagent. |
Static electricity removal sheet M | TRUSCO NAKAYAMA | SD5050 | Use while inserting beads into BIST Tip. |
SV Cartridge II | Daido Chemical Industry | ED041 | For measuring the samples by LuVEA VIII |
Table Microcentrifuge-CAPSULEFUGE | TOMY | PMC-060 | For spin-down of the mixture in each process |
Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | For preparing buffer solutions |