Summary

Estrategias para mejorar el cultivo de bacterias anaeróbicas del tracto gastrointestinal de pollo

Published: May 10, 2024
doi:

Summary

El protocolo presenta dos metodologías para mejorar el aislamiento de bacterias intestinales anaerobias. El primero se centra en el aislamiento de una amplia gama de bacterias utilizando diferentes medios de cultivo. El segundo se centra en los pasos de cultivo de un grupo microbiano específico, posiblemente asimilando mioinositol, para comprender completamente su significado ecológico.

Abstract

El tracto gastrointestinal (TGI) del pollo es un ecosistema complejo que alberga billones de microbios que desempeñan un papel fundamental en la fisiología, la digestión, la absorción de nutrientes, la maduración del sistema inmunitario y la prevención de la intrusión de patógenos del huésped. Para una salud y productividad óptimas de los animales, es imperativo caracterizar estos microorganismos y comprender su función. Si bien el TGI de las aves de corral contiene un reservorio de microorganismos con posibles aplicaciones probióticas, la mayor parte de la diversidad permanece inexplorada. Para mejorar nuestra comprensión de la diversidad microbiana no cultivada, se requieren esfuerzos concertados para llevar estos microorganismos al cultivo. El aislamiento y el cultivo de microorganismos colonizadores de GIT producen material reproducible, incluidas células, ADN y metabolitos, que ofrecen nuevos conocimientos sobre los procesos metabólicos en el medio ambiente. Sin el cultivo, el papel de estos organismos en su entorno natural sigue siendo poco claro y limitado a un nivel descriptivo. Nuestro objetivo es implementar estrategias de cultivo destinadas a mejorar el aislamiento de una amplia gama de microbios anaeróbicos del TGI del pollo, aprovechando el conocimiento multidisciplinario de la fisiología animal, la nutrición animal, la metagenómica, la bioquímica de los piensos y las estrategias modernas de cultivo. Además, nuestro objetivo es implementar el uso de prácticas adecuadas para el muestreo, el transporte y la preparación de los medios, que se sabe que influyen en el éxito del aislamiento. Las metodologías apropiadas deben garantizar un entorno constante sin oxígeno, condiciones atmosféricas óptimas, una temperatura de incubación adecuada del huésped y la provisión de requisitos nutricionales específicos en consonancia con sus necesidades distintivas. Al seguir estas metodologías, el cultivo no solo producirá resultados reproducibles para el aislamiento, sino que también facilitará los procedimientos de aislamiento, fomentando así una comprensión integral del intrincado ecosistema microbiano dentro del TGI del pollo.

Introduction

El resurgimiento del cultivo en el estudio de microorganismos ha complementado los conocimientos de los estudios metagenómicos al proporcionar material para probar hipótesis metabólicas que anteriormente solo se describían y cuantificaban parcialmente. El cultivo de bacterias intestinales proporciona material para sustentar futuras investigaciones sobre las interacciones microbiano-huésped, facilitar estudios de colonización dirigidos y mejorar los estudios de interacción molecular 1,2,3. Los conocimientos adquiridos sobre los microorganismos gastrointestinales han mejorado la nutrición y el bienestar de los animales al influir en las formulaciones de las dietas y aumentar la disponibilidad de nutrientes4. Esta comprensión ha contribuido a mejorar el rendimiento en la utilización de la interacción entre prebióticos y probióticos. Sin embargo, se requiere una investigación en profundidad para obtener una comprensión completa de cómo las condiciones bioquímicas y fisicoquímicas interactúan e impactan el perfil microbiano y su estructura. Para lograr este objetivo, el cultivo sigue siendo imperativo, ya que sirve como una herramienta crucial para profundizar en la intrincada dinámica de las comunidades microbianas dentro del entorno gastrointestinal.

En contraste con la extensa investigación sobre microbios asociados con el intestino humano y los estudios clínicos de cultivo5, los informes sobre microorganismos del ganado han utilizado predominantemente una gama limitada de medios para el aislamiento, lo que podría restringir la diversidad de aislados 2,3. Además, las mejoras en la formulación de medios y los estudios sobre la interacción del fosfato y las sales con el agar, como lo dilucidaron Tanaka et al. y Kawasaki et al., aún no se han implementado para los estudios del microbioma intestinal 6,7,8,9.

Considerado una sustancia semi-esencial, se ha reportado que el mio-inositol (MI) desempeña un papel fundamental en diversos procesos metabólicos, fisiológicos y regulatorios10,11. Estos incluyen la participación en la mineralización ósea, el desarrollo muscular de la mama, la señalización celular, la promoción de la ovulación y la fertilidad, la modulación de la señalización neuronal y la actuación como regulador de la homeostasis de la glucosa y la regulación de la insulina en las aves de corral10,11. El IM desempeña un papel como precursor a través de su interconversión dentro de procesos bioquímicos fundamentales, incluido el proceso de glucólisis/gluconeogénesis, el ciclo del ácido cítrico y la vía del fosfato de pentosa. Además, también sirve como precursor del fosfatidilinositol (PI), que está involucrado en el metabolismo de los glicerofosfolípidos12. Pocas investigaciones han reportado que la metabolización del IM conduce a alteraciones en la estabilidad ósea y el rendimiento animal. Esto incluye mejoras en la tasa de conversión alimenticia y la ganancia de peso corporal, demostrando su impacto después de la absorción y utilización dentro del animal13,14. Sin embargo, la vía para la metabolización del IM y su impacto en el metabolismo de las aves de corral sigue siendo difícil de alcanzar15. Además, pocos estudios proponen un papel potencial de las bacterias en la utilización del IM, particularmente en regiones de alta actividad metabólica como el íleon 16,17,18,19.

Los esfuerzos en el cultivo de bacterias a partir del tracto gastrointestinal de los animales tienen como objetivo mejorar las bases de datos genómicos y ampliar la investigación, verificar las hipótesis basadas en el genoma y comprender la importancia ecológica de estos recursos20. El objetivo de este trabajo es mejorar las estrategias de cultivo bacteriano a partir del TGI de pollo para potenciar la diversidad de aislamiento y el aislamiento focalizado de un grupo ecológico de interés que asimilan y metabolizan el mioinositol.

Protocol

El protocolo se divide en cuatro partes: muestreo, aislamiento bacteriano, identificación y conservación de los microorganismos obtenidos. Los permisos aprobados para el uso de animales fueron emitidos por la comisión de ética de Regierungspräsidium Tübingen, Alemania, con los números de aprobación HOH50/17 TE y HOH67-21TE. 1. Obtención de muestras para el cultivo de bacterias anaerobias Mantenimiento de animalesMant…

Representative Results

Monitoreo de las condiciones anaeróbicas durante el transporteDebido a la adición de resazurina sódica, el cambio en el color de la solución de transporte a rosa antes de la transferencia de la muestra al tubo indica una interrupción o falla en el mantenimiento de las condiciones anaeróbicas. Por lo tanto, se abstuvo de utilizar el tubo que mostraba cambio de color durante el transporte y solo se utilizaron los tubos que no mostraban cambio de color, como se pu…

Discussion

El propósito de esta metodología es mejorar el cultivo de bacterias intestinales anaeróbicas mediante la mejora de la calidad de las condiciones de muestreo, el procesamiento de muestras y la formulación y preparación de medios. Las condiciones fisicoquímicas de las muestras (pH, disponibilidad de carbono, nitrógeno y cofactores) deben tenerse en cuenta a la hora de formular los medios de cultivo. En comparación con las colecciones de cultivos bacterianos obtenidas de cerdos, hum…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen el programa de asociación Rehovot-Hohenheim y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SE 2059/7-2. Este proyecto se desarrolló como parte de la unidad de investigación P-FOWL (FOR 2601).

Materials

Acetic acid VWR 20104.334
Agar VWR 97064-332
Ammonium chloride Carl Roth P726.1
Anaerobic station Don Whitley Scientific A35 HEPA
Butyric acid Merck 8.0045.1000
Calcium chloride dihydrate  VWR 97061-904
Centrifuge Eppendorf 5424R
Chicken lysozyme (Muramidase) VWR 1.05281.0010
Cysteine VWR 97061-204
Dextrose VWR 90000-908
Di-potassium hydrogen phosphate Carl Roth P749.1
EDTA Carl Roth 8043.2
Legehennen/ Junghennenfutter Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany
MagAttract HMW DNA Kit Qiagen 67563
Magnesium chloride Carl Roth 2189.1
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0)) Westfalen Gase GmbH, Germany
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate) A&A Biotechnology 1017-10L
Myo-inositol Carl Roth 4191.2
PBS 1X ChemSolute 8418.01
Potassium dihydrogen phosphate Carl Roth 3904.2
Propionic acid Carl Roth 6026.1
QuantiFluor dsDNA System Promega E2671
RNAse A  QIAGEN Ribonuclease A (RNase A)  19101
Sodium chloride VWR 27800.291
Sodium resazurin VWR 85019-296
Sodium thioglycolate Sigma-Aldrich 102933
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-Free VWR 97064-186
Thermocycler Bio-Rad T100
Tryptone Carl Roth 8952.1
Tween80 Carl Roth 9139.2
Vitamin mix (supplement) VWR 968290NL
Vortex Star Lab 07127/92930
Yeast Extract Carl Roth 9257.05
β-D-Fructose VWR 53188-23-1

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Citar este artículo
Naithani, H., Rios-Galicia, B., Camarinha Silva, A., Seifert, J. Strategies to Enhance Cultivation of Anaerobic Bacteria from Gastrointestinal Tract of Chicken. J. Vis. Exp. (207), e66570, doi:10.3791/66570 (2024).

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