El protocolo presenta dos metodologías para mejorar el aislamiento de bacterias intestinales anaerobias. El primero se centra en el aislamiento de una amplia gama de bacterias utilizando diferentes medios de cultivo. El segundo se centra en los pasos de cultivo de un grupo microbiano específico, posiblemente asimilando mioinositol, para comprender completamente su significado ecológico.
El tracto gastrointestinal (TGI) del pollo es un ecosistema complejo que alberga billones de microbios que desempeñan un papel fundamental en la fisiología, la digestión, la absorción de nutrientes, la maduración del sistema inmunitario y la prevención de la intrusión de patógenos del huésped. Para una salud y productividad óptimas de los animales, es imperativo caracterizar estos microorganismos y comprender su función. Si bien el TGI de las aves de corral contiene un reservorio de microorganismos con posibles aplicaciones probióticas, la mayor parte de la diversidad permanece inexplorada. Para mejorar nuestra comprensión de la diversidad microbiana no cultivada, se requieren esfuerzos concertados para llevar estos microorganismos al cultivo. El aislamiento y el cultivo de microorganismos colonizadores de GIT producen material reproducible, incluidas células, ADN y metabolitos, que ofrecen nuevos conocimientos sobre los procesos metabólicos en el medio ambiente. Sin el cultivo, el papel de estos organismos en su entorno natural sigue siendo poco claro y limitado a un nivel descriptivo. Nuestro objetivo es implementar estrategias de cultivo destinadas a mejorar el aislamiento de una amplia gama de microbios anaeróbicos del TGI del pollo, aprovechando el conocimiento multidisciplinario de la fisiología animal, la nutrición animal, la metagenómica, la bioquímica de los piensos y las estrategias modernas de cultivo. Además, nuestro objetivo es implementar el uso de prácticas adecuadas para el muestreo, el transporte y la preparación de los medios, que se sabe que influyen en el éxito del aislamiento. Las metodologías apropiadas deben garantizar un entorno constante sin oxígeno, condiciones atmosféricas óptimas, una temperatura de incubación adecuada del huésped y la provisión de requisitos nutricionales específicos en consonancia con sus necesidades distintivas. Al seguir estas metodologías, el cultivo no solo producirá resultados reproducibles para el aislamiento, sino que también facilitará los procedimientos de aislamiento, fomentando así una comprensión integral del intrincado ecosistema microbiano dentro del TGI del pollo.
El resurgimiento del cultivo en el estudio de microorganismos ha complementado los conocimientos de los estudios metagenómicos al proporcionar material para probar hipótesis metabólicas que anteriormente solo se describían y cuantificaban parcialmente. El cultivo de bacterias intestinales proporciona material para sustentar futuras investigaciones sobre las interacciones microbiano-huésped, facilitar estudios de colonización dirigidos y mejorar los estudios de interacción molecular 1,2,3. Los conocimientos adquiridos sobre los microorganismos gastrointestinales han mejorado la nutrición y el bienestar de los animales al influir en las formulaciones de las dietas y aumentar la disponibilidad de nutrientes4. Esta comprensión ha contribuido a mejorar el rendimiento en la utilización de la interacción entre prebióticos y probióticos. Sin embargo, se requiere una investigación en profundidad para obtener una comprensión completa de cómo las condiciones bioquímicas y fisicoquímicas interactúan e impactan el perfil microbiano y su estructura. Para lograr este objetivo, el cultivo sigue siendo imperativo, ya que sirve como una herramienta crucial para profundizar en la intrincada dinámica de las comunidades microbianas dentro del entorno gastrointestinal.
En contraste con la extensa investigación sobre microbios asociados con el intestino humano y los estudios clínicos de cultivo5, los informes sobre microorganismos del ganado han utilizado predominantemente una gama limitada de medios para el aislamiento, lo que podría restringir la diversidad de aislados 2,3. Además, las mejoras en la formulación de medios y los estudios sobre la interacción del fosfato y las sales con el agar, como lo dilucidaron Tanaka et al. y Kawasaki et al., aún no se han implementado para los estudios del microbioma intestinal 6,7,8,9.
Considerado una sustancia semi-esencial, se ha reportado que el mio-inositol (MI) desempeña un papel fundamental en diversos procesos metabólicos, fisiológicos y regulatorios10,11. Estos incluyen la participación en la mineralización ósea, el desarrollo muscular de la mama, la señalización celular, la promoción de la ovulación y la fertilidad, la modulación de la señalización neuronal y la actuación como regulador de la homeostasis de la glucosa y la regulación de la insulina en las aves de corral10,11. El IM desempeña un papel como precursor a través de su interconversión dentro de procesos bioquímicos fundamentales, incluido el proceso de glucólisis/gluconeogénesis, el ciclo del ácido cítrico y la vía del fosfato de pentosa. Además, también sirve como precursor del fosfatidilinositol (PI), que está involucrado en el metabolismo de los glicerofosfolípidos12. Pocas investigaciones han reportado que la metabolización del IM conduce a alteraciones en la estabilidad ósea y el rendimiento animal. Esto incluye mejoras en la tasa de conversión alimenticia y la ganancia de peso corporal, demostrando su impacto después de la absorción y utilización dentro del animal13,14. Sin embargo, la vía para la metabolización del IM y su impacto en el metabolismo de las aves de corral sigue siendo difícil de alcanzar15. Además, pocos estudios proponen un papel potencial de las bacterias en la utilización del IM, particularmente en regiones de alta actividad metabólica como el íleon 16,17,18,19.
Los esfuerzos en el cultivo de bacterias a partir del tracto gastrointestinal de los animales tienen como objetivo mejorar las bases de datos genómicos y ampliar la investigación, verificar las hipótesis basadas en el genoma y comprender la importancia ecológica de estos recursos20. El objetivo de este trabajo es mejorar las estrategias de cultivo bacteriano a partir del TGI de pollo para potenciar la diversidad de aislamiento y el aislamiento focalizado de un grupo ecológico de interés que asimilan y metabolizan el mioinositol.
El propósito de esta metodología es mejorar el cultivo de bacterias intestinales anaeróbicas mediante la mejora de la calidad de las condiciones de muestreo, el procesamiento de muestras y la formulación y preparación de medios. Las condiciones fisicoquímicas de las muestras (pH, disponibilidad de carbono, nitrógeno y cofactores) deben tenerse en cuenta a la hora de formular los medios de cultivo. En comparación con las colecciones de cultivos bacterianos obtenidas de cerdos, hum…
The authors have nothing to disclose.
Los autores reconocen el programa de asociación Rehovot-Hohenheim y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SE 2059/7-2. Este proyecto se desarrolló como parte de la unidad de investigación P-FOWL (FOR 2601).
Acetic acid | VWR | 20104.334 | |
Agar | VWR | 97064-332 | |
Ammonium chloride | Carl Roth | P726.1 | |
Anaerobic station | Don Whitley Scientific | A35 HEPA | |
Butyric acid | Merck | 8.0045.1000 | |
Calcium chloride dihydrate | VWR | 97061-904 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
Chicken lysozyme (Muramidase) | VWR | 1.05281.0010 | |
Cysteine | VWR | 97061-204 | |
Dextrose | VWR | 90000-908 | |
Di-potassium hydrogen phosphate | Carl Roth | P749.1 | |
EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
Legehennen/ Junghennenfutter | Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany | – | |
MagAttract HMW DNA Kit | Qiagen | 67563 | |
Magnesium chloride | Carl Roth | 2189.1 | |
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0)) | Westfalen Gase GmbH, Germany | – | |
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate) | A&A Biotechnology | 1017-10L | |
Myo-inositol | Carl Roth | 4191.2 | |
PBS 1X | ChemSolute | 8418.01 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth | 3904.2 | |
Propionic acid | Carl Roth | 6026.1 | |
QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2671 | |
RNAse A | QIAGEN Ribonuclease A (RNase A) | 19101 | |
Sodium chloride | VWR | 27800.291 | |
Sodium resazurin | VWR | 85019-296 | |
Sodium thioglycolate | Sigma-Aldrich | 102933 | |
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-Free | VWR | 97064-186 | |
Thermocycler | Bio-Rad | T100 | |
Tryptone | Carl Roth | 8952.1 | |
Tween80 | Carl Roth | 9139.2 | |
Vitamin mix (supplement) | VWR | 968290NL | |
Vortex | Star Lab | 07127/92930 | |
Yeast Extract | Carl Roth | 9257.05 | |
β-D-Fructose | VWR | 53188-23-1 |