Aquí, presentamos un protocolo para obtener imágenes intravitales del pulmón izquierdo del ratón trasplantado utilizando microscopía de dos fotones. Esto representa una herramienta valiosa para estudiar la dinámica celular y las interacciones en tiempo real después del trasplante de pulmón murino.
Las complicaciones después del trasplante de pulmón están relacionadas en gran medida con la respuesta del sistema inmunitario del huésped al injerto. Estas respuestas inmunitarias están reguladas por la diafonía entre las células del donante y del receptor. Una mejor comprensión de estos procesos se basa en el uso de modelos animales preclínicos y se ve favorecida por la capacidad de estudiar el tráfico de células inmunitarias intrainjerto en tiempo real. La microscopía intravital de dos fotones se puede utilizar para obtener imágenes de tejidos y órganos a profundidades de hasta varios cientos de micras con un daño fotográfico mínimo, lo que ofrece una gran ventaja sobre la microscopía confocal de un solo fotón. El uso selectivo de ratones transgénicos con expresión de proteínas fluorescentes específicas del promotor y/o transferencia adoptiva de células marcadas con colorantes fluorescentes durante la microscopía intravital de dos fotones permite el estudio dinámico de células individuales dentro de su entorno fisiológico. Nuestro grupo ha desarrollado una técnica para estabilizar pulmones de ratón, que nos ha permitido obtener imágenes de la dinámica celular en pulmones naïve e injertos pulmonares trasplantados ortotópicamente. Esta técnica permite una evaluación detallada del comportamiento celular dentro de la vasculatura y en el intersticio, así como el examen de las interacciones entre varias poblaciones celulares. Este procedimiento se puede aprender y adaptar fácilmente para estudiar los mecanismos inmunológicos que regulan las respuestas inflamatorias y tolerogénicas después del trasplante de pulmón. También puede ampliarse al estudio de otras afecciones pulmonares patogénicas.
El trasplante de pulmón es la última opción para muchos pacientes que padecen enfermedad pulmonar terminal; Sin embargo, la supervivencia a largo plazo después del trasplante de pulmón es mala en comparación con otros trasplantes de órganos sólidos. La supervivencia a los 5 años es solo ~60%-70%1, en comparación con el 80%-90% en los corazones2 y el 85%-90% en los riñones3. Muchas complicaciones después del trasplante de pulmón, como la disfunción primaria del injerto, el rechazo mediado por anticuerpos y la disfunción crónica del injerto pulmonar, se deben a la respuesta inmunitaria del huésped al aloinjerto. Por ejemplo, nuestro grupo ha demostrado que los neutrófilos se reclutan rápidamente en el aloinjerto pulmonar después de una lesión por isquemia-reperfusión inducida por un trasplante y forman grupos dinámicos alrededor de los monocitos sanguíneos4. La diafonía entre las células donantes y receptoras es responsable de las respuestas aloinmunes deletéreas 5,6,7, y la capacidad de estudiar estas interacciones celulares dinámicas en un modelo animal vivo es invaluable.
La microscopía de dos fotones permite obtener imágenes intravitales de alta resolución a profundidades de hasta varios cientos de micras con un fotoblanqueo mínimo de los tejidos 8,9. Se utiliza en una variedad de tejidos y sitios anatómicos, incluyendo el neocórtex10,11, la piel12,13 y el riñón14,15. Más recientemente, se ha adaptado a órganos no estáticos como el pulmón y el corazón 4,16,17. En este protocolo, describimos una técnica para obtener imágenes de injertos pulmonares estabilizados, ventilados y perfundidos después de un trasplante de pulmón izquierdo ortotópico murino. Un beneficio clave del modelo de trasplante es la capacidad de manipular genéticamente al donante y al receptor por separado. Las poblaciones celulares individuales se pueden visualizar con cepas de ratones transgénicos con expresión de proteínas fluorescentes knock-in, transferencia adoptiva de células marcadas con fluorescencia5 o inyección intravenosa de anticuerpos marcados con fluorescencia para unirse a marcadores específicos de células 4,16,17,18.
Con el fin de estabilizar el pulmón durante la toma de imágenes, este protocolo consiste en pegar el pulmón a un cubreobjetos, mientras que otros grupos han descrito la estabilización por succión utilizando un dispositivo de vacío reversible hecho a medida19. Nuestro protocolo tiene varias ventajas, incluida una mayor área de imágenes y una relativa facilidad de configuración utilizando materiales comúnmente disponibles en un laboratorio de microscopía (incluidos cubreobjetos y pegamento). Dado que esta técnica de pegado restringe el pulmón en la superficie superior, se espera que disminuya el movimiento ventilatorio y permita obtener imágenes más profundas. Esta técnica de imagen intravital permite observar detalladamente el comportamiento y las interacciones de las células inmunitarias en tiempo real, lo que contribuye al estudio de los mecanismos inmunitarios que regulan las respuestas inflamatorias frente a las tolerogénicas tras el trasplante de pulmón.
La excitación de dos fotones fue descrita por primera vez en su tesis doctoral por Maria Göppert-Mayer en 1931, quien más tarde ganó el Premio Nobel de Física por describir la estructura de la capa nuclear22,23. La microscopía de fluorescencia tradicional se basa en la excitación de un solo fotón, con longitudes de onda de excitación que son más cortas y de mayor energía que las longitudes de onda de emisión. A difere…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo cuenta con el apoyo de subvenciones de NIH 1P01AI11650 y la Fundación para el Hospital Judío Barnes. Agradecemos al Centro de Imágenes In Vivo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington.
0.75% povidone-iodine | Aplicare | NDC 52380-0126-2 | For disinfectant |
1-inch 20G IV catheter | Terumo | SROX2025CA | For endotracheal tube (ETT) |
1-inch silk tape | Durapore | 3M ID 7100057168 | To secure mouse in position |
20x water immersion long objective lens | Olympus | N20X-PFH | |
3M Vetbond glue | Medi-Vet.com | 10872 | To glue coverglass to lung |
655 nm non-targeted quantum dots | ThermoFisher | Q21021MP | For labeling of blood vessels |
70% ethanol | Sigma Aldrich | EX0281 | For disinfectant |
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen | McKesson | 231 | |
Black O ring (2 cm) | Hardware store | N/A | For custom-built imaging chamber |
Bolt (2) | Hardware store | N/A | For custom-built imaging chamber |
Brass thumb nut (2) | Hardware store | N/A | For custom-built imaging chamber |
Buprenorphine 1.3 mg/mL | Fidelis Animal Health | NDC 86084-100-30 | For pain control |
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser | Coherent | N/A | |
Cover glass (24 mm x 50 mm) | Thomas Scientific | 1202F63 | For custom-built imaging chamber |
Curved mosquito clamp (1) | Fine Science Tools | 13009-12 | |
Dual channel heater controller | Warner Instruments | TC-344B | |
Fine scissors (1) | Fine Science Tools | 15040-11 | |
Fixed-stage upright microscope | Olympus | BX51WI | |
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm) | McKesson | 476709 | To place under left lung |
High vacuum grease | Dow Corning | N/A | To adhere coverglass onto top plate |
Isoflurane 1% | Sigma Aldrich | 26675-46-7 | For anesthesia |
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL | Vedco | NDC 50989-996-06 | For anesthesia |
Metal sheet (3 cm x 7 cm) | Hardware store | N/A | For custom-built imaging chamber |
Pointed cotton-tipped applicators | Solon | 56225 | To manipulate lung and for blunt dissection |
Power Pro Ultra clipper | Oster | 078400-020-001 | |
Puralube Vet eye ointment | Medi-Vet.com | 11897 | To prevent eye dessiccation |
Small animal ventilator | Harvard Apparatus | 55-0000 | |
Straight forceps (1) | Fine Science Tools | 91113-10 | |
Three channel shutter driver | Uniblitz | VMM-D3 | Resonant scanner |
x.y.z optical stepper motor | Prior Scientific | OptiScan II | |
Xylazine 20 mg/mL | Akorn | NDC 59399-110-20 | For pain control |