好酸球性食道炎における上皮バリアを調べるための三次元細胞培養モデル
Summary
ここでは、ヒト食道オルガノイドの培養と気液界面培養のプロトコールを提供します。食道オルガノイドの気液界面培養は、サイトカインが食道上皮バリアに及ぼす影響を研究するために使用できます。
Abstract
食道の扁平上皮は環境に直接さらされ、食物抗原や微生物などの外来抗原に絶えず直面しています。上皮バリアの完全性を維持することは、感染を予防し、無害な食品由来抗原によって引き起こされる炎症を避けるために重要です。この記事では、患者の生検からヒト食道オルガノイドおよび気液界面培養物を生成するための簡略化されたプロトコルを提供し、組織の恒常性と疾患の文脈で食道の上皮コンパートメントを研究します。これらのプロトコルは、過去10年間で重要な科学的マイルストーンであり、患者由来の初代細胞、オルガノイド、および気液界面培養からの3次元臓器様構造を記述しています。彼らは、ドナーの表現型および遺伝的特性を維持しながら、食道上皮における特定のサイトカイン、成長因子、およびシグナル伝達経路の機能を三次元フレームワーク内で調査する可能性を提供します。オルガノイドは、サイトカイン刺激後のトランスクリプトームとプロテオームを評価することにより、組織の微細構造に関する情報を提供します。対照的に、気液界面培養では、経上皮抵抗性(TEER)または高分子フラックス測定を通じて上皮バリアの完全性を評価できます。これらのオルガノイドと気液界面培養を組み合わせることで、食道上皮バリア障害疾患の研究を進めるための強力なツールとなります。
Introduction
食道の炎症は、Th2優位の食道の慢性炎症性疾患である好酸球性食道炎(EoE)で観察されるように、上皮バリアの完全性1,2,3,4,5を損なう6。EoEは1990年代に初めて報告され7,8、主に食物抗原9,10,11,12,13によって誘導されます。成人集団で最も頻繁に発生するEoEの症状は、嚥下障害と食物宿便です14。小児では、EoEは通常、成長の失敗、食物拒否、嘔吐、および腹痛を伴って現れます15。ゲノムワイド関連解析(GWAS)により、上皮バリアの完全性に関与するEoEリスク遺伝子が特定され、上皮がEoE研究の焦点となっている16,17,18。さらに、EoEトランスクリプトミクスは、分化過程の障害と反応性基底帯過形成が食道上皮のバリア機能の低下を引き起こすことを明らかにしました3,5,19,20,21,22。EoEがTh2媒介性疾患であるという初期の理解6は、上皮の完全性を乱すことによる駆動メディエーターとしてのIL-13の発見につながった3,4,21,23。遺伝的素因を通じて、内因性バリア障害から上皮の完全性に対するサイトカイン媒介性の影響を解剖できる実験システムは、EoEにおける免疫細胞と上皮との間の複雑な相互作用を研究する可能性を提供します。ヒト食道オルガノイドと気液界面(ALI)培養物は、サイトカイン刺激が上皮完全性に及ぼす影響を分析するための貴重なツールとして提案されています5。
成体組織特異的幹細胞(ASC)由来の食道オルガノイドを作製するための最初のプロトコルは、2009年に腸オルガノイドの最初の発表報告から5年後に確立され、腸内Lgr5+ ASCを使用して小腸の上皮コンパートメントを再現した24。DeWardらは、マウスの食道上皮細胞からオルガノイドを作製する先駆者となった25。2018年、笠木らは、不死化ヒト食道扁平上皮細胞株EPC2-hTERTおよび初代患者由来細胞からヒト食道オルガノイドを作製した26。同年、Zhangらは人工多能性幹細胞(iPSC)由来の食道オルガノイドの作製に成功しました。彼らは、食道前駆細胞(EPC)の発生に対するTGFβおよび骨形態形成タンパク質(BMP)阻害の重要性と、層状扁平上皮の分化におけるNotchシグナル伝達の重要な役割を描写しました26,27。Trisnoらは、Sox2を、発生の運命を食道分化に導くWnt阻害剤として同定することで、これらの知見を補完した28。その後のプロトコル、培地組成、および培養条件の改良により、オルガノイドの形成速度が増加し、凍結保存後のオルガノイドの継代および回収が可能になりました26,29,30,31,32。これらのオルガノイドは、サイトカインによる刺激後の組織構造と潜在的な標的遺伝子の発現を研究するための強力なツールですが、食道オルガノイドは、バリア完全性の直接的な尺度として経上皮耐性(TEER)または高分子フラックスを測定する可能性を提供しません。Sherrillら22が以前に述べたように、上皮分化をモデル化するALI培養4は、上皮の完全性を直接評価することを可能にする。患者由来オルガノイドとALI培養物を組み合わせることは、EoEにおける組織構造と上皮バリアの完全性を研究するための強力なツールです。
ここでは、食道生検から生存細胞を単離し、サイトカインがバリアインテグリティに及ぼす影響をさらに研究するために使用できる食道オルガノイドおよびALI培養を確立するための手順を示します。
Protocol
この手続きは、北西および中央スイスの倫理委員会(EKNZ;Project-ID 2019-00273)。すべての患者は、内視鏡検査の前に生検の実験的使用について書面によるインフォームドコンセントを提供しました。この試験で使用された試薬および機器は、 材料表に記載されています。 1. 患者由来の食道オルガノイドの細胞単離 注:ヒト食道オル?…
Representative Results
食道オルガノイドは、倒立明視野顕微鏡で文書化されたように、提供されたプロトコルの指示に従って、患者の生検から抽出された初代細胞から増殖します(図1)。上皮ASCは、単離された細胞を基底膜抽出物に播種した後、培養の最初の2日以内に自己組織化的に細胞クラスターを形成し始め、足場として機能します。細胞クラスターのサイズと数は、倒立明視野顕微鏡で…
Discussion
提供される手順により、患者由来のオルガノイドとALI培養の培養が可能になり、成功の見込みが高いです。オルガノイドプロトコルは、ヒト食道オルガノイド26の生成を報告した最初に公開されたプロトコルから、および最近発表されたプロトコル32から適応された。Sherill氏らは、ALIモデル22について説明しました。オルガノイドとALI培養…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SNSFのJ.H.N.への助成金310030_219210は、この原稿の出版を制限なく支援しました。 図 1 は、BioRender.com の助けを借りて作成されました。
Materials
| 1250 µL Griptip – Filter | Integra | 4445 | |
| 300 µL Griptip – Filter | Integra | 4435 | |
| 70 µM cell strainer | Sarstedt | 83.3945.070 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich (Merck) | A4544 | |
| Bovine pituitary extract | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | |
| Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures | Greiner Bio-One | 7.657 185 | |
| Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear | R&D Systems (Bio-Techne) | 3532-010-02 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade | Carl Roth | A994 | |
| Dispase I | Corning | 354235 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich (Merck) | D4693 | |
| Dulbeccos Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich (Merck) | D8537 | |
| EVE Automated Cell Counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| EVE Cell counting slide | NanoEntek | EVS-050 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran | Sigma-Aldrich (Merck) | FD4 | average mol wt 3000-5000 |
| Heraeus – Megafuge 40R | Thermo Fisher Scientific | 75004518 | |
| Human recombinant epidermal growth factor | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Keratinocyte-SFM | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 17005042 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 15140122 | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein | R&D Systems (Bio-Techne) | 251-KG-010/CF | |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Single Channel EVOLVE 100-1000 µL | Integra | 3018 | |
| Single Channel EVOLVE 20-200 µL | Integra | 3016 | |
| Syringe 1 mL | 1134950 | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich (Merck) | T9128 | |
| Trypsin-EDTA | SAFC Biosciences (Merck) | 59418C | |
| Y27632 dihydrochloride | Tocris (Bio-Techne) | 1254 |
Referencias
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Citar este artículo
Kaymak, T., Niess, J. H. Three-Dimensional Cell Culture Models to Investigate the Epithelial Barrier in Eosinophilic Esophagitis . J. Vis. Exp. (207), e66503, doi:10.3791/66503 (2024).