Este protocolo describe un ensayo extracromosómico de unión de extremos no homólogos (NHEJ) y un ensayo de recombinación homóloga (HR) para cuantificar la eficiencia de NHEJ y HR en células HEK-293T.
Las roturas de doble cadena de ADN (DSB) representan las lesiones de ADN más peligrosas, capaces de inducir una pérdida sustancial de información genética y la muerte celular. En respuesta, las células emplean dos mecanismos principales para la reparación de DSB: unión de extremos no homólogos (NHEJ) y recombinación homóloga (HR). Cuantificar la eficiencia de la NHEJ y la HR por separado es crucial para explorar los mecanismos y factores relevantes asociados con cada uno. El ensayo NHEJ y el ensayo HR son métodos establecidos que se utilizan para medir la eficiencia de sus respectivas vías de reparación. Estos métodos se basan en plásmidos meticulosamente diseñados que contienen un gen de proteína verde fluorescente (GFP) interrumpido con sitios de reconocimiento para la endonucleasa I-SceI, que induce DSB. Aquí, describimos el ensayo extracromosómico NHEJ y el ensayo HR, que implican la co-transfección de células HEK-293T con plásmidos EJ5-GFP/DR-GFP, un plásmido que expresa I-SceI y un plásmido que expresa mCherry. Los resultados cuantitativos de la eficiencia de NHEJ y HR se obtienen calculando la proporción de células positivas para GFP y células mCherry positivas, según se cuentan mediante citometría de flujo. A diferencia de los ensayos cromosómicamente integrados, estos ensayos extracromosómicos son más adecuados para realizar investigaciones comparativas que involucran múltiples líneas celulares estables establecidas.
Una rotura de doble cadena de ADN (DSB) es la forma más deletérea de daño en el ADN, que puede provocar inestabilidad del genoma, reordenamientos cromosómicos, senescencia celular y muerte celular si no se reparacon prontitud. Dos vías bien establecidas, la unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la recombinación homóloga (HR), son reconocidas por su eficacia en el tratamiento de los DSB de ADN 2,3. HR se considera un mecanismo libre de errores para la reparación de DSB, utilizando secuencias homólogas en la cromátida hermana como plantilla para restaurar la configuración original de la molécula de ADN dañada3. NHEJ, por otro lado, es una vía de reparación de DSB propensa a errores que se une a los extremos rotos del ADN sin depender de ninguna plantilla2.
El ensayo NHEJ y el ensayo HR son métodos clásicos desarrollados originalmente en el laboratorio de Jasin en el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center y utilizados para cuantificar la eficiencia de NHEJ y HR, respectivamente 4,5,6,7. Estos ensayos juegan un papel crucial en la investigación de los mecanismos y factores relevantes asociados con NHEJ y HR 8,9,10,11,12,13,14. Ambos ensayos se basan en la implementación de dos reporteros de GFP interrumpidos, EJ5-GFP y DR-GFP, para monitorear la reparación de DSB inducidos por la endonucleasa I-SceI. El reportero EJ5-GFP se emplea en el ensayo NHEJ, mientras que el reportero DR-GFP se utiliza en el ensayo HR. Cada reportero está sutilmente diseñado para que los DSB inducidos por I-SceI solo puedan ser reparados por una vía de reparación específica para restaurar un casete de expresión GFP 4,5.
El ensayo NHEJ y el ensayo de FC se pueden realizar utilizando un abordaje cromosómicamente integrado o extracromosómico15,16. El enfoque cromosómicamente integrado requiere la integración de los reporteros de GFP alterados en el genoma, lo que permite el análisis de la reparación de DSB dentro de un contexto cromosómico 6,15. Sin embargo, este enfoque requiere un paso celular prolongado y no es adecuado para estudios comparativos que involucren múltiples líneas celulares debido a la integración cromosómica arbitraria, lo que introduce un factor de confusión adicional aparte de las diferencias inherentes. En este protocolo, describimos el ensayo extracromosómico NHEJ y los ensayos HR, que implican la transfección transitoria de los plásmidos GFP e I-SceI interrumpidos en células HEK-293T, seguida de un análisis de citometría de flujo (el flujo de trabajo del experimento se muestra en la Figura 1). Estos ensayos reporteros no integrados fueron reportados originalmente por el laboratorio de Jasin para estudiar la reparación de los enlaces cruzados entre hebras de ADN16 y han sido empleados para evaluar la eficiencia de NHEJ y la eficiencia de HR por varios laboratorios 9,10,11,12,13,14,17,18,19, incluido el nuestro 11. Estos enfoques extracromosómicos facilitan el análisis de la reparación de DSB en estudios comparativos que involucran múltiples líneas celulares estables establecidas.
El método aquí descrito ha sido empleado en varios trabajos para evaluar la eficiencia de la NHEJ y la eficiencia de la HR 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Este método es pertinente para …
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación fue financiada por la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Heilongjiang de China (YQ2022C036) y la Fundación de Innovación para Graduados de la Universidad Médica de Qiqihar (QYYCX2022-06). Figura 1 producida con MedPeer.
6 cm dishes | BBI | F611202-9001 | |
6 well plates | Corning | 3516 | |
Ampicillin | Beyotime | ST007 | Working concentration: 100 μg/mL |
DH5α Competent Cells | TIANGEN | CB101 | |
DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
DR-GFP | Addgene | 26475 | |
EJ5-GFP | Addgene | 44026 | |
EndoFree Maxi Plasmid kit | TIANGEN | DP117 | alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used |
FACS tubes | FALCON | 352054 | |
Fetal bovine serum | CLARK | FB25015 | |
Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | |
FlowJo V.10.1 | Treestar | alternative analysis software can be used | |
HEK-293T cells | National Infrastructure of Cell Line Resource | 1101HUM-PUMC000091 | |
Lipo3000 | Invitrogen | L3000015 | alternative transfection regents can be used |
PBS | Biosharp | BL601A | |
pCBASceI | Addgene | 26477 | I-SceI expressing plasmid |
PCI2-HA-mCherry | alternative plasmids containing DsRed can be used | ||
Trypsin | Gibco | 25200-056 |