Intrathekale Vektorverabreichung bei juvenilen Ratten über die Injektion in die Lendenwirbelsäule
Summary
Es wird ein chirurgischer Eingriff beschrieben, bei dem Injektionen in die Lendenwirbelkammer der juvenilen Ratte durchgeführt werden. Dieser Ansatz wurde für die intrathekale Verabreichung von Gentherapie-Vektoren verwendet, aber es wird erwartet, dass dieser Ansatz für eine Vielzahl von Therapeutika, einschließlich Zellen und Medikamenten, verwendet werden kann.
Abstract
Die Gentherapie ist eine leistungsstarke Technologie, um einem Patienten neue Gene zur Behandlung einer Krankheit zuzuführen, sei es zur Einführung eines funktionellen Gens, zur Inaktivierung eines toxischen Gens oder zur Bereitstellung eines Gens, dessen Produkt die Biologie der Krankheit modulieren kann. Die Verabreichungsmethode für den therapeutischen Vektor kann viele Formen annehmen, die von der intravenösen Infusion zur systemischen Verabreichung bis zur direkten Injektion in das Zielgewebe reichen. Bei neurodegenerativen Erkrankungen ist es oft wünschenswert, die Transduktion in Richtung Gehirn und/oder Rückenmark zu verzerren. Der am wenigsten invasive Ansatz, der auf das gesamte Zentralnervensystem abzielt, ist die Injektion in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF), wodurch das Therapeutikum einen großen Teil des Zentralnervensystems erreichen kann. Der sicherste Ansatz, einen Vektor in den Liquor zu verabreichen, ist die lumbale intrathekale Injektion, bei der eine Nadel in die lumbale Zisterne des Rückenmarks eingeführt wird. Diese Technik, die auch als Lumbalpunktion bekannt ist, wurde häufig bei Neugeborenen und erwachsenen Nagetieren sowie in Großtiermodellen eingesetzt. Während die Technik über alle Spezies und Entwicklungsstadien hinweg ähnlich ist, erfordern subtile Unterschiede in Größe, Struktur und Elastizität des Gewebes, das den intrathekalen Raum umgibt, Anpassungen im Ansatz. In diesem Artikel wird ein Verfahren zur Durchführung einer Lumbalpunktion bei juvenilen Ratten beschrieben, um einen Adeno-assoziierten Serotyp-9-Vektor zu verabreichen. Hier wurden 25-35 μl Vektor in die lumbale Zisterne injiziert, und ein grün fluoreszierender Protein-Reporter (GFP) wurde verwendet, um das Transduktionsprofil zu bewerten, das sich aus jeder Injektion ergibt. Die Vorteile und Herausforderungen dieses Ansatzes werden diskutiert.
Introduction
Das Versprechen viral vermittelter Gentherapien wurde in den letzten Jahren mit der FDA-Zulassung von Behandlungen für spinale Muskelatrophie, Netzhautdystrophie, Faktor-IX-Hämophilie, Krebs und mehr endlich verwirklicht 1,2,3,4. Unzählige weitere Therapeutika befinden sich derzeit in der Entwicklung. Die Gentherapie zielt darauf ab, ein therapeutisches Gen in die Zellen eines Patienten zu bringen. Die Produkte dieses neuen Gens können die fehlende Aktivität eines mangelhaften endogenen Gens ersetzen, ein toxisches Gen hemmen, Krebszellen abtöten oder eine andere nützliche Funktion erfüllen.
Bei Erkrankungen, die das Zentralnervensystem (ZNS) betreffen, ist es oft wünschenswert, den Gentherapievektor direkt an das Zielgewebe zu verabreichen. Nicht-systemische Ansätze bieten zwei Vorteile: Sie minimieren Off-Target-Nebeneffekte, die durch periphere Transduktion verursacht werden können, und sie reduzieren die Menge an Vektoren, die benötigt wird, um ein angemessenes Transduktionsniveau im Zielgewebe zu erreichen, erheblich5.
Es gibt eine Vielzahl von Ansätzen, um Gentherapie-Vektoren an das ZNS zu verabreichen. Die intraparenchymale Injektion, die Injektion eines Vektors direkt in das Rückenmark oder das Hirngewebe, kann zur Verabreichung in eine definierte Region verwendet werden. Bei vielen Erkrankungen ist jedoch eine breite Transduktion des ZNS erwünscht. Dies kann erreicht werden, indem ein Vektor in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF)5 abgegeben wird, die Flüssigkeit, die in und um das Gehirn und das Rückenmark fließt. Es gibt drei Hauptmethoden, um Vektoren an das CSF zu liefern. Der invasivste Ansatz ist die intrazerebroventrikuläre Verabreichung, bei der ein Bohrloch durch den Schädel gebohrt und eine Nadel durch das Gehirn in die Seitenventrikel vorgeschoben wird. Dies führt zu einer Transduktion im gesamten Gehirn. Das Verfahren kann jedoch zu intrakraniellen Blutungen führen, und der Ansatz führt in der Regel nur zu einer eingeschränkten Transduktion des Rückenmarks6. Die Injektion in die Cisterna magna an der Schädelbasis ist weniger invasiv, birgt aber das Risiko einer Schädigung des Hirnstamms. Während die Injektion in die Cisterna magna in der Tierforschung häufig eingesetzt wird5, wird sie in der Klinik nicht mehr routinemäßig angewendet7. Die Lumbalpunktion ist der am wenigsten invasive Ansatz für den Zugang zum Liquor. Dabei wird eine Nadel zwischen zwei Lendenwirbeln in den Lendenwirbel eingeführt.
Die Lumbalpunktion zur Vektorverabreichung wird routinemäßig bei adulten Ratten und Mäusen sowie bei neugeborenen Mäusen durchgeführt 8,9. Die Autoren dieser Studie führten kürzlich Lumbalpunktionen bei juvenilen Ratten (im Alter von 28-30 Tagen) durch, um Adeno-assoziierte Virus-Serotyp 9 (AAV9)-Vektoren zu liefern. Bei erwachsenen Ratten wurde eine Lumbalpunktionsnadel bei Neugeborenen senkrecht zwischen den Wirbeln L3 und L4 platziert9. Die richtige Platzierung führt zu einem Schwanzschlag und Liquor fließt in das Nadelreservoir. Bei juvenilen Ratten konnte jedoch keiner dieser Messwerte erreicht werden. Die Autoren versuchten dann, ein Verfahren an eine adulte Maus anzupassen, bei der eine 27-G-Insulinspritze in einem Winkel zwischen L5 und L6 eingeführt wurde10. Bei erwachsenen Mäusen, die typischerweise kleiner als P28-Ratten sind, führt dies nicht zu einem Schwanzschlag, aber eine falsche Nadelplatzierung ist durch den Rückfluss des Injektats offensichtlich. Bei juvenilen Ratten führte dieser Ansatz jedoch einheitlich dazu, dass das Injektionsmuster epidural verabreicht wurde, was wahrscheinlich auf die unterschiedliche Elastizität der Gewebeschichten, die das Rückenmark umgeben, zwischen adulten Mäusen und juvenilen Ratten zurückzuführen ist. Als nächstes wurden Katheteransätze evaluiert. Konkret wurde ein Katheter durch einen Schnitt in der Dura des lumbalen Spülkastens und bis zum mittleren thorakalen Rückenmark eingeführt; Dieser Ansatz führte jedoch zu einem erheblichen Rückfluss des Injektats aus der Inzisionsstelle während der Verabreichung. Auch Versuche, den Katheter mit einer Führungsnadel perkutan in den intrathekalen Raum zu platzieren, waren erfolglos. Aufgrund der Enge der interlaminaren Breite würde der Katheter wahrscheinlich die rostrale Lamina treffen und nicht vorstoßen.
Hier wird eine Methode beschrieben, um eine erfolgreiche und reproduzierbare Lösungsabgabe über eine Lumbalpunktion bei der juvenilen Ratte zu erreichen. Dieser Ansatz kann für virale Vektoren und wahrscheinlich auch für Zellen, Pharmazeutika und andere Therapeutika verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das ZNS ist von den unterschiedlichsten Erkrankungen betroffen. Die Bereitstellung einer funktionellen Kopie des relevanten Gens über einen viralen Vektor ist eine attraktive Behandlungsstrategie für solche, die rezessiv und monogen Natur sind, wie z. B. spinale Muskelatrophie. Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) schließt jedoch die meisten intravenös verabreichten Gentherapievektoren aus11. Diejenigen, die die BHS überwinden können, wie z. B. AAV9, müssen in hohen Dosen verabreicht werden, um den…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi und Lacey Stearman von UT Southwestern für eine produktive Diskussion über die Herausforderung, die jugendliche Ratten für die intrathekale Injektion darstellen. Diese Arbeit wurde teilweise durch Mittel von Jaguar Gene Therapy (an JLFK) unterstützt.
Materials
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 – 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
Referencias
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