生肉からの カンピロバクター 属菌の検出と分離

このプロトコルに関連するすべての作業は、無菌状態を維持し、サンプル汚染またはオペレーターによる微生物病原体への曝露のリスクを最小限に抑えるために、生物学的安全キャビネット(BSC)内で実施する必要があります。サンプルをBSC外に移す場合は、密閉容器を使用して、誤って落下した場合にこぼれないようにし、サンプルの完全性を維持してください。好ましくは、クロスコンタミネーションの可能性を軽減するために、手順全体を通して使い捨てのコンポーネントを使用する必要があります。使い捨てが不可能な場合は、使用前にすべての機器と材料が滅菌されていることを確認してください。適切な廃棄物管理は非常に重要です。使用済みの使い捨て部品はすべて、バイオハザード廃棄物として廃棄する必要があります。適切な滅菌を確実にし、潜在的に危険な物質の封じ込めを避けるために、廃棄する前に材料をオートクレーブします。これらの予防措置を遵守することで、サンプルの完全性が保護されるだけでなく、オペレーターが微生物病原体にさらされるリスクを最小限に抑えることができます。 図 1 は、 カンピロバクター 種のサンプル調製、選択的濃縮、フィルターベースの単離、mqPCR による分化のワークフローを示しています。 補足ファイル1 は、プロセス全体のより詳細なワークフローと画像を示しています。 1.肉サンプルの調製 食肉サンプルの採取鶏もも肉、手羽先、ドラムスティック、レバーなど、さまざまな新鮮な肉のパッケージを地元の小売店から入手してください。 すべてのサンプルを4°Cの保管場所に移し、受領後24時間以内に処理します。注:新鮮なサンプルを氷点下などの低温で保管すると、回収に影響します。 食肉サンプルの加工FSISサンプリングガイドライン6,17で規定されている成分の比率に従ってください。 各パッケージから450gの鶏肉を切り取り、ストマッカーバッグに入れます( 材料表を参照)。注:ストマッカーバッグは、下流工程を保証するのに十分な機械的強度を持ち、破裂や漏れがないため、推奨されます。 緩衝ペプトン水(BPW)を調製します。20gの粉末( 材料表を参照)を1Lの精製水に溶解します。溶液を121°Cで15分間オートクレーブします。溶液を滅菌水で0.1%の濃度に希釈します。 鶏肉の入ったストマバッグに200 mLの0.1%BPWを加えます。 ストマッカーバッグの外側からサンプルを手動でマッサージ/触診して2分間。 電動ピペットコントローラーを使用して、バッグのろ過された側からすべてのチキンリンスを収集します( 材料表を参照)。 チキンリンスを滅菌遠心分離機ボトルに分注します。室温で10,000 x g で10分間遠心分離します。 25 mLの使い捨て血清プラスチックピペットを備えた電動ピペットコントローラーを使用して、上清を慎重に回収します。ペレットを乱さないでください。 必要に応じてこのプロセスを繰り返し、すべての上清が除去されるようにします。 採取した上清を捨てる。 2. 生肉からのカンピロバクターの選択的濃縮 サプリメントによるボルトンブロスの調製13.8gの粉末( 材料表を参照)を500mLの精製水に溶解します。121°Cで15分間オートクレーブ滅菌して培養液を滅菌します。 滅菌した500 mLのボルトンブロスに25 mLのレーキングした馬の血液( 材料表を参照)を加えます。注:馬の血液の添加は、酸素消冷剤として機能し、食品マトリックスから損傷した カンピロバクター 細胞の回復を助けます。 抗生物質サプリメント(セフォペラゾン、シクロヘキシミド、トリメトプリム、バンコマイシン、材料 表を参照)1バイアルを5 mLの50%エタノールで再構成します。. 再構成された抗生物質サプリメントをボルトンブロスに加えます。 濃縮手順湖沼化した馬の血液と抗生物質を含む50 mLのボルトンブロスにペレットを再懸濁します。 サンプル(キャップを緩めた状態)を、85%N2、10%CO2、および5%O2の混合ガスを維持する密閉容器に入れます。キャップが緩んでいることを確認してくださいが、 カンピロバクターの微好気性および好熱性の成長要件を生成するために容器がしっかりと密閉されています。注:85%N2、10% CO2、および5%O2 の雰囲気を維持するガスパックは、恒温槽が利用できない場合に使用できます。 サンプルを42°Cで24時間インキュベートします。 3. 生鶏からのC.jejuniおよびC.大腸菌の単離と精製 ブルセラ寒天プレートの調製28gのブルセラ粉末( 材料表を参照)を1Lの精製水に溶解します。寒天15gをブルセラ液に溶解します。 ブルセラ寒天培地を121°Cで15分間オートクレーブ滅菌します。 中寒天混合物を55°Cのウォーターバスで冷却します。 20 mLのブルセラ寒天を直径100 mmのシャーレに注ぎます。 濾過法及びコロニー培養バイオセーフティキャビネットで蓋を開けた状態でブルセラ寒天プレートを0時間、1時間、2時間、3時間乾燥させることにより、フィルターを通過する カンピロバクター に対する水分の影響を評価します。 80 μLのサンプルをブルセラ寒天プレートに直接広げて、フィルターなしのコントロールを調製します。 酢酸セルロースフィルター(0.45 μmまたは0.65ポアサイズ、 材料表を参照)をブルセラ寒天プレートの中央に配置します。 フィルターに4滴/フィルターと20μL/滴の濃縮サンプルをピペットで移します。フィルターの中央付近に滴を置き、プレートに到達した液体がフィルターの周りではなくフィルターを通過するようにします。 滴が広がって凝集しないように滴を置きます。 滴を室温で15分間インキュベートし、フィルターを慎重に取り外します。注:このステップにより、 カンピロバクター 細胞が膜を通過し、過度に乾燥することなく寒天培地に到達するのに十分な時間を確保します。 プレートを42°Cで約24時間、前述の微好気的条件下でインキュベートします。 特定の形質を持つ特徴的な カンピロバクター のコロニーを選びます。注: カンピロバクター のコロニーは通常、丸みを帯びており、縁が滑らかで、光沢があり、半透明の黄色がかったまたはピンクがかった色をしています6。 精製のためにブルセラ寒天プレートにコロニーを縞状にします。単一の均一なコロニー形態のプレートが得られるまで、このステップを繰り返します。 長期保存用のサンプルを調製します。前述のようにボルトンブロスを準備します。均一なコロニー形態のプレートからコロニーを1つ追加します。 前述の微好気性条件下で一晩(24時間)成長させます。100 μL の DMSO を含む 2 mL のクライオバイアルに 900 μL の一晩培養液を加えます。 ドライアイスエタノール浴(約-72°C)で10分間急冷します。-80°Cの冷凍庫に移し、長期保存してください。 4. C. jejuni および C. coli の種の同定 以前に開発されたマルチプレックスqPCR(mqPCR)アッセイを使用して、C.jejuniおよびC.coliの種レベルの同定を実行します18,19。迅速な細胞溶解とゲノムDNA抽出を96ウェルプレートフォーマットで行います。注:サンプルに既知のPCR阻害剤が十分に含まれていないことを確認するために、市販のキット( 材料表を参照)の使用を検討することを強くお勧めします。精製した カンピロバクター コロニーを100μLの抽出液に分散させます。 サンプルを99°Cで10分間溶解した後、サーモサイクラーで20°Cで2分間冷却します。 プレートを室温で8,000 x g で10分間遠心分離します。mqPCRアッセイのために上清のアリコート2 μLを除去します。 10 μL の 2x Master Mix、2.0 μL の DNA サンプル、104 コピーの内部増幅コントロール(IAC)テンプレート、および各プライマーとプローブ 200 nM からなる 20 μL の反応混合物を調製します( 材料表を参照)。注: hipO および cdtA のプライマーおよびプローブは、それぞれ C. jejuni および C. coliの排他的な標的遺伝子である。IAC は、ヒトアデノウイルスの 79 bp の DNA セグメントで構成されており、すべてのサンプルで DNA ポリメラーゼの活性を一定に保つためのポジティブコントロールとして含まれています。 すべてのサンプルを光学フィルムで覆われた96ウェル光学プレートに3回に分けてロードし、リアルタイムPCRシステムに入れます( 材料表を参照)。DNAポリメラーゼを95°Cで10分間ホットスタート活性化します。その後、95°Cで15秒間40サイクルの変性を行い、60°Cで1分間アニーリング/伸長を行います。 5. 細胞懸濁液の列挙 6 x 6 ドロッププレート手順20 を使用して細胞懸濁液を列挙します。6 x 6 ドロップ プレート法を示す画像については、 補足ファイル 1 を参照してください。 ブルセラ寒天プレートを蓋を外して層流フードで45分間風乾します。 200 μL の細菌懸濁液を 96 ウェルプレートの最初のカラムの 6 列(A-F)に加えます。 180 μLのブルセラ培地を残りの列(2〜12列)の6列に分配します。 20 μL のトランスファーを使用して 10 倍段階希釈液を調製します。例えば、20 μL のサンプルをカラム 1 からカラム 2 に移します。このプロセスを少なくとも 6 列繰り返します。 リフラックスは、ピペットを使用して各懸濁液を10回混合し、各移送のたびにチップを交換します。 マルチチャンネルピペットを使用して、ブルセラ寒天プレートの表面に6列のカラムから7 μLの滴を堆積させます。 これを繰り返して 6 x 6 の配列を作成し、行が列間で技術的なレプリケートになるようにします。 プレートを5分間風乾してから、プレートを反転させます。プレートを42°Cで24時間インキュベートします。 各代表希釈液のコロニー数を数えます。