Producción de cultivos en suspensión y purificación de virus adenoasociados mediante centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol para aplicaciones in vivo

Los vectores virales adenoasociados recombinantes (rAAV) son herramientas ampliamente utilizadas para el tratamiento de enfermedades genéticas, como la atrofia muscular espinal, la distrofia retiniana y la hemofilia A ^1,2,3. Los vectores rAAV están diseñados para carecer de genes virales presentes en el AAV⁴ de tipo salvaje, un virus icosaédrico pequeño y sin envoltura con un genoma lineal de ADN monocatenario de 4,7 kb. El AAV se descubrió por primera vez en la década de 1960 como un contaminante de las preparaciones de adenovirus⁵. A pesar de su pequeño tamaño de cápside, que limita el tamaño del transgén que se puede empaquetar a un máximo de 4,9 kb excluyendo los RTI⁶, el AAV es útil para la administración de transgenes porque no es patógeno en humanos, permite la expresión del transgén en muchos tipos de células que se dividen y no se dividen, y tiene efectos inmunogénicos limitados⁷.

Como miembros del género dependoparvovirus, la producción de rAAVs se basa en la expresión de genes auxiliares presentes en el adenovirus o virus del herpes simple⁸. Se han desarrollado varias estrategias para producir rAAV, pero la producción en células HEK293 transformadas con los genes auxiliares adenovirales E1A/E1B es el método más establecido y utilizado en la actualidad⁹. El enfoque general de la producción de rAAV comienza con la transfección de células HEK293 con tres plásmidos que contienen el transgén dentro de repeticiones terminales invertidas (ITR), genes AAV rep y cap , y genes auxiliares adenovirales adicionales, respectivamente. Setenta y dos horas después de la transfección, las células se cosechan y procesan para purificar el rAAV que contiene el transgén.

En el desarrollo de nuevos vectores rAAV con fines terapéuticos, uno de los principales objetivos es producir vectores con una mayor eficiencia de transducción. Un aumento en la eficiencia de transducción de las células diana significaría una disminución de la dosis clínica necesaria de rAAV, disminuyendo así la probabilidad de efectos inmunogénicos adversos que van desde la neutralización mediada por anticuerpos hasta toxicidades agudas^10,11. Para mejorar la eficacia de la transducción de los vectores rAAV, se pueden realizar alteraciones en el genoma empaquetado o en la cápside. Los métodos viables para ajustar la eficacia de la transducción a través del diseño del genoma empaquetado incluyen la incorporación de promotores fuertes y específicos de tejido, la selección cuidadosa de los elementos de procesamiento del ARNm y la optimización de la secuencia de codificación para mejorar la eficiencia de la traducción¹². Las alteraciones de la cápside se realizan con el objetivo de aumentar el tropismo para los tipos de células humanas diana. Los esfuerzos para desarrollar nuevas cápsidas de vectores de administración de transgenes rAAV generalmente se caracterizan por un enfoque en el diseño racional de cápsidas de AAV con mutaciones específicas dirigidas a receptores celulares específicos o la evolución dirigida para identificar cápsidas con tropismo para tipos celulares específicos a partir de bibliotecas de cápside combinatorias de alta complejidad sin dirigirse a un receptor específico (aunque algunos grupos combinan estos enfoques)^{13, 14,15}. En el enfoque de evolución dirigida, las bibliotecas combinatorias de la cápside se construyen utilizando una columna vertebral de serotipo particular con regiones variables mutadas en el exterior de la cápside¹⁶. Las bibliotecas combinatorias de cápside a menudo se construyen a partir de serotipos de AAV que no se originan en humanos, lo que disminuye el riesgo de inmunidad preexistente durante el uso clínico¹⁰. Por lo tanto, los métodos de purificación que se pueden aplicar a cualquier serotipo son ideales para eliminar la necesidad de una optimización específica del serotipo para los serotipos menos utilizados que sirven como columna vertebral para estas bibliotecas.

La centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol se utiliza para purificar altos títulos de rAAV con alta infectividad¹⁷. En este protocolo, el rAAV se produce en cultivo celular en suspensión para disminuir la cantidad de mano de obra necesaria para producir grandes títulos de AAV. También se incluye un paso de centrifugación para limpiar el lisado celular para reducir la presencia de proteínas contaminantes y disminuir el riesgo de precipitación de virus. Este protocolo es un método rentable para producir preparaciones de rAAV de alta pureza adecuadas para uso preclínico.