Summary

El TD Drive: un implante paramétrico de código abierto para registros electrofisiológicos multiárea en ratas que se comportan y duermen

Published: April 26, 2024
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Summary

Aquí, presentamos un implante único imprimible en 3D para ratas, llamado TD Drive, capaz de registros simétricos de electrodos de alambre bilaterales, actualmente en hasta diez áreas cerebrales distribuidas simultáneamente.

Abstract

Las intrincadas interacciones entre múltiples áreas del cerebro subyacen a la mayoría de las funciones atribuidas al cerebro. El proceso de aprendizaje, así como la formación y consolidación de recuerdos, son dos ejemplos que dependen en gran medida de la conectividad funcional a través del cerebro. Además, la investigación de las similitudes y/o diferencias hemisféricas va de la mano con estas interacciones multizonas. Por lo tanto, los estudios electrofisiológicos que intentan dilucidar aún más estos procesos complejos dependen del registro de la actividad cerebral en múltiples lugares simultáneamente y, a menudo, de manera bilateral. Aquí se presenta un implante imprimible en 3D para ratas, llamado TD Drive, capaz de realizar grabaciones simétricas de electrodos de alambre bilaterales, actualmente en hasta diez áreas cerebrales distribuidas simultáneamente. El diseño de código abierto se creó empleando principios de diseño paramétrico, lo que permite a los posibles usuarios adaptar fácilmente el diseño de la unidad a sus necesidades simplemente ajustando parámetros de alto nivel, como las coordenadas antero-posteriores y mediolaterales de las ubicaciones de los electrodos de registro. El diseño del implante se validó en n = 20 ratas Lister Hooded que realizaron diferentes tareas. El implante era compatible con grabaciones de sueño atadas y grabaciones de campo abierto (Object Exploration), así como con la grabación inalámbrica en un gran laberinto utilizando dos sistemas de grabación comerciales diferentes y headstages. Así, se presenta aquí el diseño y montaje adaptable de un nuevo implante electrofisiológico, facilitando una rápida preparación e implantación.

Introduction

La naturaleza multiárea de las interacciones cerebrales durante la vigilia y el sueño dificulta el estudio exhaustivo de los procesos fisiológicos en curso. Si bien enfoques como la resonancia magnética funcional (fMRI) y la ecografía funcional (fUS) permiten muestrear la actividad cerebral de cerebros completos 1,2, explotan el acoplamiento neurovascular para inferir la actividad cerebral a partir de la actividad hemodinámica, limitando su resolución temporal2. Además, la resonancia magnética funcional requiere la colocación del sujeto de investigación en un escáner de resonancia magnética, lo que prohíbe los experimentos con animales que se mueven libremente. La obtención de imágenes ópticas de la dinámica del calcio con imágenes de uno o varios fotones permite el registro simultáneo de cientos de neuronas específicas del tipo de célula3. Sin embargo, los microscopios montados en la cabeza, como el Miniscope3, que permiten el movimiento libre, generalmente se limitan a obtener imágenes de áreas corticalessuperficiales en cerebros intactos. Si bien el diámetro de su campo de visión en la corteza puede ser del orden de 1 mm, los requisitos de espacio de estos microscopios montados en la cabeza pueden dificultar el objetivo de varias áreas, especialmente las adyacentes. Por lo tanto, para capturar con precisión la dinámica cerebral multiárea en vigilia y sueño, la electrofisiología extracelular, registrada con electrodos implantados en las áreas cerebrales de interés, es uno de los métodos de elección debido a su alta resolución temporal y precisión espacial5. Además, permite la caracterización de la dinámica del sueño en animales compatible con análisis obtenidos a partir de EEG humano, incrementando el valor traslacional de este método6.

Clásicamente, los estudios que registran la actividad cerebral con electrodos extracelulares han empleado electrodos de alambre individuales o haces de electrodos,como los tetrodes. Las sondas de última generación como la sonda Neuropixels8 permiten apuntar a varias áreas simultáneamente, dado que están alineadas en un eje que permite implantar la sonda a lo largo de ese eje sin perjudicar al animal. Sin embargo, los registros simultáneos precisos de múltiples áreas separadas espacialmente siguen siendo un desafío, ya que los métodos existentes son costosos o requieren mucho tiempo.

En los últimos años, los métodos de fabricación aditiva, como la estereolitografía, se han vuelto ampliamente disponibles. Esto permitió a los investigadores desarrollar nuevos implantes de electrodos que se adaptaban a sus requisitos experimentales9, por ejemplo, la focalización repetible simplificada de múltiples áreas cerebrales. Con frecuencia, estos diseños de implantes también se comparten con la comunidad académica como hardware de código abierto, lo que permite a otros investigadores adaptarlos a sus propios fines. El grado de adaptabilidad de los implantes específicos varía tanto en función de cómo se diseña el implante como de cómo se comparte. El modelado paramétrico10 es un enfoque popular en el diseño asistido por computadora, en el que los diferentes componentes del diseño están vinculados por parámetros interdependientes y un historial de diseño definido. La implementación de un enfoque paramétrico para el diseño de implantes aumenta su reutilización y adaptabilidad10, ya que el cambio de parámetros individuales actualiza automáticamente los diseños completos sin la necesidad de una remodelación compleja del diseño. Una necesidad consecuente es que el diseño en sí se comparta en un formato editable que conserve las relaciones paramétricas y la historia del diseño. Los formatos de archivo que solo representan primitivas geométricas, como STL o STEP, hacen que las modificaciones paramétricas posteriores de los modelos publicados sean inviables.

Si bien los hiperimpulsoresde tetrodo 11,12,13 permiten grabaciones de docenas de tetrodos, su ensamblaje e implantación requieren mucho tiempo y su calidad depende en gran medida de la habilidad y experiencia del investigador individual. Además, suelen combinar los tubos guía que dirigen los electrodos de registro a su ubicación objetivo en uno o dos haces más grandes, lo que limita el número y la dispersión de las áreas que se pueden apuntar de manera eficiente.

Otros implantes 14,15 exponen todo el cráneo y permiten la libre colocación de múltiples microdrives individuales que llevan los electrodos de registro. Si bien la colocación de microunidades independientes16 durante el tiempo de cirugía maximiza la flexibilidad, aumenta el tiempo de cirugía y puede dificultar el enfoque de múltiples áreas adyacentes debido a los requisitos de espacio de las microunidades individuales. Además, aunque los implantes son de código abierto, solo se publican como archivos STL, lo que dificulta su modificación.

Un ejemplo de una unidad con una filosofía paramétrica más inherente es el RatHat17. Al proporcionar una plantilla quirúrgica que cubre toda la superficie dorsal del cráneo, permite apuntar con precisión a múltiples objetivos cerebrales sin el uso de un marco estereotáctico durante la cirugía. Están disponibles múltiples variaciones de implantes para cánulas, optrodes o tetrodes. Sin embargo, aunque la unidad es de uso gratuito para fines académicos, no se publica de código abierto, lo que crea un obstáculo para que los investigadores evalúen y utilicen el implante.

En este artículo se presenta el TD Drive (ver Figura 1), un novedoso implante imprimible en 3D para el registro de electrodos extracelulares en ratas. El TD Drive tiene como objetivo superar algunos de los inconvenientes de las soluciones existentes: permite dirigirse a múltiples áreas del cerebro, reflejadas en ambos hemisferios, con electrodos de cable independientes simultáneamente. Debido a su diseño simple, puede ser ensamblado en unas pocas horas a un costo relativamente bajo por investigadores menos experimentados. El TD Drive se publica de código abierto, en formatos de archivo fácilmente modificables para permitir a los investigadores ajustarlo a sus necesidades específicas. La incorporación de un enfoque de modelado 3D paramétrico desde el principio del proceso de diseño del TD Drive permite abstraer los parámetros necesarios para cambiar: para cambiar las ubicaciones de los objetivos, los investigadores pueden simplemente editar los parámetros que representan sus coordenadas dorsoventral y anteroposterior, sin necesidad de rediseñar el accionamiento ellos mismos. Los archivos para modificar y fabricar el TD Drive se pueden encontrar en https://github.com/3Dneuro/TD_Drive.

Figure 1
Figura 1: Descripción general de la TD Drive. (A) Representación de una TD Drive con una tapa protectora. (B) Renderizado con las partes internas mostradas. El TD Drive cuenta con (a) múltiples ubicaciones de grabación ajustables paramétricamente para cables de electrodos fijos y móviles, un EIB con (b) un conector Omnetics de alta densidad compatible con sistemas comunes de adquisición de datos conectados e inalámbricos, y (c) un mapeo de canales intuitivo optimizado para grabaciones con sistemas Intan/Open Ephys (ver Figura complementaria 1) y (d) una tapa para proteger el implante durante las grabaciones atadas y cuando no hay ningún cabezal conectado. (C) Una plantilla de guía en la parte inferior del TD Drive facilita la colocación de cánulas guía y sirve como una verificación redundante de las ubicaciones de los implantes durante la cirugía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El diseño del implante se pilotó en n = 4, se validó en n = 8 y se confirmó en n= 8 ratas Lister Hooded que realizaron diferentes tareas. Los primeros 4 animales se utilizaron para desarrollar el accionamiento y ajustar los parámetros. Luego, se ejecutó un piloto completo con 8 animales (se muestra en los resultados). Se realizó una segunda cohorte de 8 animales y se incluyó en el análisis de supervivencia del implante. El implante era compatible con grabaciones de sueño atadas y grabaciones de campo abierto (Object Exploration), así como con la grabación inalámbrica en un gran laberinto (HexMaze 9 m x 5 m) utilizando dos sistemas de grabación comerciales diferentes y headstages. Las dos cohortes de 8 se grabaron con dos sistemas de adquisición diferentes: atado para grabaciones de sueño más largas e inalámbrico para grabaciones de exploración de laberintos grandes. Podemos concluir que este simple cable permite experimentos de larga duración con cohortes más grandes por parte de investigadores menos experimentados para permitir el análisis de las etapas del sueño, así como el análisis de la oscilación en múltiples áreas del cerebro. Esto contrasta con la mayoría de los implantes de electrofisiología hasta la fecha, que, debido a la dificultad y la intensidad del tiempo, permiten cohortes de animales más pequeñas y, por lo general, necesitan experimentadores muy experimentados. Sin embargo, con este impulso, no se puede registrar la actividad de las neuronas individuales; por lo tanto, el uso se limita a las investigaciones del potencial de campo local (LFP) y la actividad de sumatoria.

Protocol

El presente estudio fue aprobado por la Comisión Central Holandesa Dierproeven (CCD) y se llevó a cabo de acuerdo con la Ley de Experimentos con Animales (códigos de protocolo: 2020-0020-006 y 2020-0020-010). Se utilizaron ratas macho Lister Hooded de 9-12 semanas a su llegada. Los reactivos y el equipo utilizado en el protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales. Consulte la Figura complementaria 1 y la Figura complementaria 2 para conocer los pasos del proceso de construcción de la unidad. 1. Ajuste y creación de modelos 3D y datos de la placa de interfaz de electrodos (EIB) Abra el diseño del cuerpo de la unidad en Autodesk Fusion. Haga clic en Cambiar parámetros en la pestaña Modificar . Ajuste las coordenadas de la primera ubicación de grabación introduciendo la coordenada anteroposterior en anteroPosteriorSite1 y la coordenada mediolateral en medioLateralSite1. Se puede ajustar el diámetro del orificio para el tubo guía o los electrodos ajustando el diámetroSitio1. Repita el procedimiento para grabar las ubicaciones 2 y 3, y el diseño del modelo se ajustará automáticamente.NOTA: Las tres ubicaciones utilizadas para el protocolo actual son el hipocampo (HPC), que contiene haces de cables móviles, y la corteza prefrontal (PFC) y retroesplenial (RSC), ambas con haces de cables fijos (el haz de cables PFC se dirige tanto a la corteza prelímbica (PRL) como a la corteza cingulada anterior (ACC)). En la Tabla 1 se indican los límites impuestos manualmente a los parámetros que controlan las coordenadas mediolaterales de los sitios de registro. Exporte el cuerpo de la unidad actualizado haciendo clic con el botón derecho del ratón sobre él en el navegador y seleccionando Guardar como malla. Seleccione el tipo STL (binario), unidades mm y refinamiento alto. Seleccione los archivos STL preparados para el límite normal o, si es necesario (por ejemplo, cuando los objetivos son muy laterales), los archivos STL preparados para los límites grandes. Dependiendo del tope que se elija, se selecciona el BEI regular o el grande para la producción. Los archivos de producción de Gerber para ambos BEI se proporcionan como archivos zip que se pueden enviar directamente a un servicio de fabricación. 2. Impresión de los modelos 3D y fabricación del BEI NOTA: Para el presente estudio, se utilizó una impresora 3D disponible comercialmente para producir las piezas (ver Tabla de Materiales). Cuando se utilizan diferentes impresoras o se externaliza la producción, es posible que sea necesario utilizar resinas diferentes y comparables para producir las piezas. Imprima el cuerpo de la unidad y las lanzaderas utilizando estereolitografía9 con una alta resolución en una resina normal o biocompatible (por ejemplo, resina transparente, negra o blanca) con una altura de capa de 25 μm. Imprime las piezas de la tapa con una resina fuerte y resistente (por ejemplo, Tough 2000). Fabrica el BEI internamente o encarga su producción a un proveedor de servicios externo. Suelde el conector de alta densidad al EIB utilizando técnicas de soldadura SMD (dispositivo montado en superficie).NOTA: Cuando no se tiene experiencia en la soldadura de componentes electrónicos finos, se recomienda que la soldadura se realice externamente, por ejemplo, en el taller de electrónica de la universidad o en un proveedor comercial. Refuerce el conector de alta densidad soldado aplicando un epoxi fuerte alrededor del conector. Tenga cuidado de no cubrir los orificios de los electrodos con epoxi. 3. Post-procesamiento del cuerpo impreso en 3D NOTA: La tapa y las lanzaderas no deberían necesitar procesamiento posterior. Dependiendo de la calidad de las impresiones 3D, es posible que deban lijarse ligeramente o eliminar los restos de soporte. Al lijar y taladrar, tenga cuidado de no romper las paredes del cuerpo de la transmisión. Si es necesario, limpie las piezas posprocesadas con isopropanol y, un paño suave y/o aire comprimido. Taladre los orificios para los tubos guía en la parte superior e inferior del cuerpo de la transmisión con una broca de 0,5 mm montada en un tornillo de banco. Esto garantiza que las dimensiones sean correctas y coherentes en todos los sitios. Taladre los dos orificios avellanados (como en la Figura 2E) en el cuerpo de la unidad para el inserto de latón de la lanzadera con una broca de 2 mm en un tornillo de banco. Limpie los orificios avellanados de los escombros de perforación con aire comprimido. A continuación, golpee los orificios guía para los tornillos de lanzadera, que son la extensión de los orificios avellanados, con un grifo M1. Realice el golpeteo en dos o más iteraciones, limpiando los residuos del grifo y el agujero entre iteraciones. Opcionalmente, lubrique el grifo con una gota de aceite mineral. Limpie el cuerpo de la unidad de los residuos de perforación y roscado con aire comprimido. Figura 2: Representación de la TD Drive. (A,B) TD Drive (A) sin y (B) con una tapa protectora en un modelo de cráneo de rata. (C) Tubos guía de poliimida insertados correctamente en cada uno de los seis sitios de registro. (D) Un conjunto de lanzadera aislado y completo con el tornillo guía, la lanzadera impresa en 3D y el inserto de latón soldado. (E) Cuerpo TD Drive con dos lanzaderas insertadas. Marcados en rojo: (a) orificios avellanados para la lanzadera, (b) guía de la lanzadera, (c) pedestales centrales del cuerpo de la transmisión, (d) plantilla de guía. (F,G) Las ubicaciones importantes en la parte superior (F) e inferior (G) del cuerpo de la unidad que podrían requerir un procesamiento posterior después de la impresión 3D se indican con una flecha roja cada una. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 4. Conjuntos de lanzaderas Desliza una lanzadera impresa en 3D sobre un tornillo M1x16. Utilice un inserto de latón M1 para mantener la lanzadera impresa en 3D en su lugar. La lanzadera debe poder girar libremente sin moverse hacia arriba o hacia abajo después de colocar el inserto.PRECAUCIÓN: Los siguientes pasos contienen riesgos de quemaduras (soldadura). Dependiendo de la soldadura y el fundente de soldadura utilizados, pueden incluir la exposición a irritantes respiratorios y plomo. Siempre use protección para los ojos cuando suelde (ya que la soldadura puede chisporrotear) y siga las pautas adecuadas para el manejo seguro de sustancias potencialmente dañinas, incluida la ventilación adecuada del espacio de trabajo para extraer los humos de soldadura. Siga las regulaciones locales y los procedimientos operativos o consulte el material disponible en línea18,19. Con una pequeña cantidad de pasta de soldar, suelde el inserto de latón al tornillo. Tenga cuidado de no sobrecalentar el inserto y el tornillo para no derretir la lanzadera impresa en 3D. Dependiendo de la resina utilizada para la impresión 3D de la lanzadera, es difícil evitar una pequeña cantidad de fusión (y, posteriormente, que la lanzadera se pegue al inserto).NOTA: Cuando se utilizan tornillos de acero inoxidable, es posible que se requiera fundente de soldadura. Se recomienda utilizar tornillos de latón o de acero para máquinas, ya que son más fáciles de soldar. Después de enfriar el conjunto de la lanzadera, gire suavemente la lanzadera impresa en 3D varias veces alrededor del tornillo. Si la lanzadera se fusionó con el inserto durante la soldadura, esto debería liberarlo.NOTA: Asegúrese de que la lanzadera pueda girar libremente y que no se tambalee. Si es así, deseche el conjunto de la lanzadera y comience uno nuevo. Intente girar con cuidado el inserto de latón. Si gira con respecto al tornillo, repita el proceso de soldadura. 5. Montaje de la unidad Corte tubos de poliimida disponibles en el mercado de aproximadamente 25 mm de longitud, pero al menos lo suficientemente largos como para extenderse a través de todo el cuerpo de la transmisión. Inserte los tubos guía de poliimida en el cuerpo de la unidad. Cada tubo debe insertarse a través de un orificio en la parte superior de la unidad y el orificio correspondiente en la plantilla guía en la parte inferior de la unidad (“d” en la Figura 2E). Los tubos deben insertarse hasta que estén al ras con la parte superior del cuerpo de la transmisión. Con una aguja fina o un palillo de dientes, aplique una pequeña cantidad de pegamento líquido de cianoacrilato en los orificios de la parte superior del cuerpo de la unidad para fijar los tubos guía en su lugar. Aplique el pegamento desde la parte inferior del cuerpo para evitar que el pegamento entre en contacto con los tubos guía. El pegamento será atraído hacia el espacio entre el cuerpo de la transmisión y el tubo guía por fuerzas capilares y, por lo tanto, conectará los dos. Aplique una pequeña cantidad de pegamento de cianoacrilato a la interfaz entre los tubos guía y la plantilla guía en la parte inferior del cuerpo de la unidad. Nuevamente, tenga cuidado de no obstruir los tubos guía con pegamento. Deja que el pegamento se seque durante unos minutos.NOTA: La cantidad exacta de tiempo necesario depende del material de transmisión y de la holgura entre el cuerpo de transmisión y los tubos guía. En general, 5-10 minutos deberían ser suficientes. Dé la vuelta al cuerpo de la unidad y corte los tubos guía de poliimida en la parte inferior de modo que se extiendan aproximadamente 1 mm más allá de los pedestales centrales del cuerpo de la unidad (“c” en la Figura 2E y la Figura 2 complementaria). En esta configuración, el extremo de los tubos guía quedará al ras de la superficie cerebral en el momento de la implantación.NOTA: La unidad fue desarrollada para apuntar a áreas más profundas del cerebro. Si se dirigen las áreas corticales superficiales, pueden ser necesarios tubos guía de poliimida más cortos para no lesionar la superficie cerebral en caso de inflamación cerebral inicial. Inserte dos conjuntos de lanzadera en el cuerpo de la transmisión. Al atornillarlos en los orificios de guía roscados, asegúrese de que los tornillos estén paralelos a las guías de la lanzadera (“b” en la Figura 2E). Use los dedos para alinear suavemente las lanzaderas con las guías de las lanzaderas. Atornille completamente las lanzaderas en los orificios avellanados para verificar que los insertos de latón del conjunto de la lanzadera no se atasquen en el cuerpo de la transmisión ni choquen con los tubos guía de poliimida. Para este protocolo, se requiere una distancia mínima de 16 vueltas completas. Si no se alcanza, corte aún más el tubo de poliimida en la parte superior del cuerpo de la unidad para crear más espacio. No apriete demasiado la lanzadera en el cuerpo de la transmisión, ya que esto puede destruir las roscas atrapadas en el cuerpo de la unidad y la conexión de soldadura del conjunto de la lanzadera.NOTA: Si un conjunto de lanzadera se atasca, retírelo por completo y verifique si la conexión de soldadura se aflojó. En ese caso, utilice un nuevo conjunto de lanzadera. Si el conjunto de la lanzadera choca con un tubo guía, acorte el tubo guía para que no se extienda más allá del cuerpo de la transmisión. Atornille el EIB al cuerpo de la unidad con tornillos de poliimida M2.5×5. Aplique unas gotas de cola de cianoacrilato entre el cuerpo de la unidad y el EIB. Asegúrese de no obstruir los orificios pasantes para la conexión de los electrodos. 6. Preparación de la cubierta protectora Inserte una tuerca M2 de acero inoxidable en la extrusión en la mitad izquierda de la tapa y fíjela con pegamento de cianoacrilato. Si es necesario, perfore el orificio en la parte delantera de la tapa izquierda con una broca M1 en un tornillo de banco. Golpee el orificio en la parte delantera de la mitad de la tapa derecha con un grifo M1. 7. Preparación de los electrodos de alambre Prepare dos placas metálicas como superficie para crear los haces de alambre de electrodos. Las placas sirven como una superficie plana, estable, pero móvil en la que se realizará el ensamblaje, el pegado y el corte del haz de alambre. Pega papel de trazado en la primera placa y anuda dos cintas de pintor adhesivas en la segunda placa, con la superficie adhesiva apuntando hacia arriba. Tres de los cuatro cables de los haces de HPC se cortarán en un ángulo de 60 grados para crear un desplazamiento en la dirección dorsoventral. Esto permitirá la colocación de un alambre por encima, dentro y por debajo de la capa piramidal del hipocampo, respectivamente. Para facilitar el corte, dibuje una línea clara con un ángulo de 60 grados en el papel de trazado (línea de 60 grados). Para cada haz de electrodos HPC, corte 4 trozos de alambre de electrodo de una longitud de 4,5 cm cada uno. Para cada haz de electrodos PFC y RSC, corte 4 trozos de alambre de electrodos de una longitud de 3,5 cm cada uno. Levante suavemente 4 cables tocándolos con la yema de un dedo (se pegarán a él) y colóquelos lo más cerca posible uno al lado del otro en la cinta de pintor. Asegúrese de no ponerlos uno encima del otro. Bajo un microscopio, use fórceps para colocar los cables lo más cerca posible. Aplique una capa delgada de pegamento de cianoacrilato líquido en los primeros 2 cm de la parte superior del paquete. Para el paquete de HPC, pegue > 2 cm y < 3,5 cm del alambre. Espera a que el pegamento se seque. Toque los alambres suavemente con unas pinzas bajo un microscopio. Si no se separan, se pegan correctamente. Como prueba de cordura, asegúrese de que la capa de pegamento brille bajo la iluminación del microscopio. Una vez que esté completamente seco, retire el haz de alambre de la cinta y transfiéralo a la placa con el papel de trazado. Bajo un microscopio, revise el haz de alambre para ver si hay exceso de pegamento en la parte superior o en los lados, y retírelo con cuidado con una hoja de bisturí. Para los haces RSC, haga un corte recto en la parte inferior de la matriz, perpendicular a la dirección de los cables. Para los paquetes de HPC, coloque la matriz en el papel de trazado de modo que se cruce con la línea de 60 grados y use la línea como guía para hacer un corte en ángulo de 60 grados con respecto a la dirección de los cables.Luego, use una hoja de bisturí para dividir con cuidado el más corto de los 4 cables del paquete. Corte el alambre perpendicular a la dirección del alambre, acortándolo a aproximadamente 0,75 mm en comparación con el segundo alambre más largo del paquete. Para los haces PFC, divida la parte inferior de la matriz en dos haces de 2 hilos. Asegúrese de que los dos cables estén bien pegados entre sí. Acorte uno de los haces de 2 hilos en 1 mm cortándolo perpendicular a la dirección del cable. Consulte la Figura complementaria 1 (abajo) y la Figura complementaria 2b para ver imágenes de los haces de alambre cortados. 8. Preparación del cable de tierra y los cables de EEG Empuje al menos 10 de los pines SIP/DIP fuera de una regleta de enchufes SIP/DIP interconectada con paso de 1,27 mm. Corta 2 piezas de 6 cm de longitud para el cable de tierra (GND). Corta 8 piezas de 6 cm de longitud para el alambre del EEG. Use una hoja de bisturí para quitar con cuidado parte del aislamiento de ambos extremos de todos los cables. Coloque un tornillo de acero inoxidable M1x3 en una tercera mano, dejando el mayor espacio posible accesible debajo de la cabeza del tornillo. Envuelva un lado desaislado de un cable GND o EEG alrededor del vástago del tornillo, justo debajo de la cabeza del tornillo. Aplique una pequeña cantidad de fundente de soldadura con una aguja pequeña o un palillo de dientes. Suelda el cable al tornillo. Asegúrese de no obstruir accidentalmente la ranura de la cabeza del tornillo. Coloque un pin SIP/DIP en la tercera mano para que el lado hembra sea accesible. Inserte la parte desaislada del lado opuesto del cable en el pin SIP/DIP. Aplique una pequeña cantidad de fundente de soldadura y suelde el cable a la clavija. Retire el conjunto de alambre roscado soldado del soporte. Este ensamblaje se implantará en el cráneo durante la cirugía de implantación. Coloque otro pin SIP/DIP en el soporte, girado 180 grados (es decir, accesible desde el lado macho). Aplique una pequeña cantidad de fundente de soldadura y suelde un lado desaislado del otro cable al lado macho del pin. Retire el conjunto de clavijas de alambre soldadas del soporte. Este conjunto se conectará posteriormente al EIB, y el conjunto de tornillo-alambre, así como el conjunto de cable-pasador, se conectarán entre sí durante la cirugía de implantación utilizando sus dos clavijas. Para reforzar las conexiones soldadas, aplique una pequeña cantidad de pegamento de cianoacrilato a la conexión entre los cables y las clavijas. Una vez que el pegamento se haya secado, verifique que los pines SIP/DIP de los dos ensamblajes se puedan conectar sin problemas. Utilice la opción de verificación de continuidad de un multímetro para verificar que haya una conexión continua entre el tornillo y el extremo del cable desaislado del conjunto de clavija de cable cuando ambos conjuntos estén conectados. Opcionalmente, codifique por colores cada juego de alambres con esmalte de uñas (consulte la Tabla de materiales) para simplificar la conexión correcta durante la cirugía de implante. 9. Carga de los haces de cables en la unidad Conecte la unidad a un soporte. Tenga cuidado de no aplicar demasiada presión al EIB o dañar el conector de alta densidad en este paso. Una vez que el cuerpo de la unidad esté en una posición estable, tome uno de los haces de cables y deslícelo con cuidado en el tubo de poliimida correspondiente, ya sea con la mano o con un par de pinzas finas. Asegúrese de que la matriz de cables esté colocada en la orientación correcta (por ejemplo, para la matriz PFC, los dos cables más largos de la matriz deben estar orientados hacia la media) y tenga cuidado de no doblar la matriz de cables. Repita el último paso para todos los demás haces de cables. Use una pinza delgada para agarrar uno de los cables y dóblelo con cuidado hacia el orificio en el que desea insertarlo. Una vez insertado, use un alfiler de oro para clavarlo en el orificio EIB. Repita esto para todos los cables del paquete y para todos los paquetes.Asegúrese de que, durante esta etapa, los cables formen un bonito bucle por encima del EIB (de esta manera, todavía hay espacio para mover el haz hacia arriba y hacia abajo del tubo de poliimida para ajustar la longitud en la parte inferior del tubo) y que la matriz que sobresale de la parte inferior del tubo de poliimida no se doble accidentalmente. Asegúrese de anotar qué cable de cada haz de cables se conecta a cada canal en el EIB. Véase la Figura 1 suplementaria para obtener una explicación detallada de la asignación de canales del TD Drive.NOTA: Alternativamente, después de cargar cada haz de cables (paso 9.2), se pueden conectar directamente los cables al EIB (paso 9.4) y luego continuar con el paso 9.2 + 9.4 para los haces de cables restantes. Esto puede variar en función de las preferencias personales de los experimentadores. Consulte la Figura complementaria 2b para ver un ejemplo de una unidad TD cargada. Ajuste la longitud de los haces de cables para apuntar correctamente a las ubicaciones de grabación empujando o tirando suavemente de los haces de cables hacia adentro o hacia afuera del tubo guía (consulte la Figura complementaria 2d).NOTA: A medida que los tubos guía se cortan para quedar al ras de la superficie del cerebro, la distancia a la que un haz de cables se extiende más allá del tubo guía corresponde a la ubicación dorsoventral del área objetivo. Los haces de cables HPC móviles deben estar alineados con la parte inferior del tubo guía, los haces RSC fijos deben extenderse 1,5 mm y los haces PFC fijos deben extenderse 3,5 mm más allá de los tubos guía. Al empujar o tirar de los conjuntos de cables, tenga cuidado de no sacar cables individuales del EIB en la parte superior o de doblar la parte inferior del haz de cables. Cuando las matrices de cables fijos (RSC y PFC) estén alineadas, aplique una pequeña cantidad de pegamento epoxi fuerte en la parte superior de los tubos guía, pegando los haces en su lugar. Mientras se cura el epoxi, asegúrese de que los haces de alambre aún estén correctamente alineados en la parte inferior. Para fijar los conjuntos de cables HPC móviles, primero mueva la lanzadera a la posición más alta requerida (en los experimentos descritos en este artículo, al menos 16 vueltas completas/4 mm por encima de la posición más baja). A continuación, empuje los haces de cables en la abertura en forma de U de la lanzadera y péguelos en su lugar con una pequeña cantidad de un pegamento epoxi fuerte.NOTA: Asegúrese de que el epoxi no corra por el paquete hacia el tubo de poliimida. Cuando el epoxi esté curado, aplique una segunda capa de epoxi en el mismo lugar para reforzar la conexión y hacer que sea menos probable que la conexión se rompa cuando se mueve la lanzadera. Inserte con cuidado el extremo abierto del conjunto de clavijas de un cable GND a través de uno de los orificios pasantes marcados como GND y fíjelo con un alfiler dorado.NOTA: Cuando se utiliza una etapa principal en la que los canales GND y de referencia (REF) están en cortocircuito, también se puede utilizar un canal REF si es más conveniente. Retire la unidad del soporte; Tenga cuidado de no doblar ninguno de los conjuntos de cables. Vuelva a colocar la parte delantera de la unidad en el mismo soporte e inserte 4 conjuntos de clavijas de cable de EEG en los orificios pasantes para los canales de EEG (marcados con 2,4, 29, 31) y fíjelos con un alfiler dorado cada uno. Para todos los cables GND y EEG, use un multímetro en la configuración de continuidad para verificar la conexión continua entre el pin dorado en el EIB y el pin del conjunto cable-pin conectado. Guarde la unidad. Esto se puede hacer, por ejemplo, colocando la tapa en el cuerpo de la unidad y almacenándola boca abajo.NOTA: Antes de la implantación quirúrgica, esterilice la parte inferior de la unidad con etanol. Todos los tornillos óseos y los conjuntos de cables GND/EEG deben esterilizarse en etanol. Los instrumentos quirúrgicos deben esterilizarse a través de un autoclave. 10. Cirugía de implantes impulsivos NOTA: Este paso describe brevemente los procedimientos quirúrgicos para implantar el TD Drive. Un protocolo de implantación más extenso, que incluye una descripción de las herramientas, así como las dosis y concentraciones de los fármacos, se puede encontrar en el Archivo Complementario 1. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos y limpiar y desinfectar el área quirúrgica siguiendo las directrices institucionales locales. Para esterilizar los implantes, coloque las partes de los cables de los electrodos que estarán en contacto con el cerebro en etanol durante al menos un minuto.NOTA: La exposición prolongada al etanol o sus vapores puede debilitar el pegamento de cianoacrilato. Si los humos no están atrapados, prolongue el tiempo de inmersión de los cables en etanol. Para verificar la integridad del pegamento, se recomienda encontrar el momento óptimo con un implante de prueba que no se utilice en un experimento real. Proporcionar la analgesia preventiva necesaria, los antibióticos y la anestesia gaseosa (isoflurano) de acuerdo con las directrices institucionales y locales. Coloque a la rata en el aparato estereotáctico. Afeitar la parte superior de la cabeza y desinfectar la piel con povidona yodada. Por vía subcutánea, aplique anestésico local (lidocaína) y haga una pequeña incisión en el cráneo en la parte superior de la línea media. Exponga el cráneo tirando de la piel hacia un lado. Extraer el tejido conectivo de la parte superior del cráneo, secar y limpiar la superficie del cráneo. Separe suavemente los músculos del costado del cráneo para permitir la colocación de tornillos de anclaje. Mida las coordenadas bregma y lambda. Para una orientación precisa, asegúrese de que la superficie del cráneo sea paralela al plano anteroposterior-mediolateral de la estereotasa midiendo la diferencia en la posición dorsoventral de bregma y lambda. Si las coordenadas difieren, ajuste la posición de la rata en estereotasa subiendo o bajando la boquilla. Marque las craneotomías alrededor de las ubicaciones objetivo (corteza prelímbica (AP +3,5 mm y ML + -1 mm), retroesplenial (AP+5,8 mm y ML +-1 mm e hipocampo (AP -3,8 mm y ML + – 2,5 mm)). Taladre orificios para tornillos GND/EEG y tornillos de anclaje. Inserte los tornillos y cúbralos con acrílico dental líquido. Taladre las craneotomías y retire con cuidado la duramadre. Evite que las craneotomías se sequen mediante la aplicación de solución salina estéril. Coloque con cuidado el TD Drive encima de las craneotomías, asegurándose de que los tubos guía estén al ras del cráneo. Proteja los tubos guía con vaselina y fije el TD Drive al cráneo con acrílico dental. Baje lentamente las matrices de cables dirigidas a la HPC desde su ubicación inicial (~1,5 mm DV desde la superficie del cerebro) hacia la capa piramidal del hipocampo CA1. La capa piramidal se alcanzó progresivamente en los días siguientes durante los controles de señal en el período de recuperación de las ratas. Coloque la tapa protectora alrededor de la unidad. Apague la anestesia con gas y retire la rata del marco estereotáctico. Coloque a la rata en una jaula limpia dentro de una cámara calentada y proporciónele comida húmeda y agua para su recuperación. Vigila a la rata hasta que vuelva a estar activa, moviéndose en la jaula, comiendo y bebiendo. Lleva a la rata de vuelta a la habitación de la vivienda. Proporcionar analgesia postoperatoria y cuidados de acuerdo con los lineamientos institucionales. Por ejemplo, vea el ejemplo de protocolo de cirugía en el Archivo Complementario 1. 11. Recuperación del BEI Al final del experimento, recupere la unidad y retire la cubierta protectora. Retire los alfileres dorados y conecte los cables de los electrodos con cuidado. Desatornille el EIB del cuerpo de la unidad. Empujando suavemente unas pinzas suaves entre el EIB y el cuerpo de la unidad o levantando cuidadosamente el EIB con la mano, suelte la unión de cianoacrilato restante que sujeta el EIB al cuerpo. Limpie el EIB y los pasadores de oro para reutilizarlos en los implantes TD Drive posteriores. Antes de reutilizar un EIB, verifique que las vías de clavija dorada y el conector de alta densidad no estén desgastados. Solo reutilice el EIB si las vías están lo suficientemente intactas como para permitir una buena conexión entre los pines de oro, los cables de los electrodos y el EIB y si la conexión del conector de alta densidad a la etapa principal aún es lo suficientemente estable.

Representative Results

Usando las instrucciones proporcionadas en el protocolo, el TD Drive podría ser construido fácilmente por múltiples experimentadores. Después del desarrollo de la unidad (n = 4), se ejecutó un piloto completo con ocho animales. Se implantó un lote adicional de ocho animales y se realizó la recolección de datos experimentales. Dado que no se ha completado el análisis de los datos de estos animales, se han incluido en el análisis de supervivencia, pero no en otros análisis (por …

Discussion

En este artículo se presenta un implante adaptable para registros de electrodos de alambre bilaterales, simétricos y multiárea para ratas que se mueven libremente.

La capacidad de ajustar fácilmente el implante cambiando los parámetros predefinidos fue una de las motivaciones para la creación del TD Drive. Si bien se pretende maximizar la flexibilidad para cambiar los parámetros, las limitaciones inherentes a las relaciones entre ellos imponen necesaria…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores quieren agradecer a Angela Gómez Fonseca por la inspiración para desarrollar la unidad y a todos los estudiantes que realizaron experimentos piloto con los animales, Milan Bogers, Floor van Ravenswoud y Eva Severijnen. Este trabajo contó con el apoyo del Consejo Holandés de Investigación (NWO; Programa Crossover 17619 “INTENSE”).

Materials

0.5 mm drill bit  McMaster 2951A38
1.27 mm pitch interconnected SIP/DIP socket (Mill-Max) Mouser Electronic 575-003101 For essembling and connection of EEG & GND screws
5 minute epoxy  Bison Commercially available regular off-the-shelf epoxy
cyanoacrylate glue Loctite Super Glue-3 
EEG wire Science Products GmbH 7SS-2T
Electrode wire Science Products GmbH NC7620F
Ethanol LC For standard pre-operative sterilization procedure of drive
Fine forceps (5) FST 91150-20 For wire bundle preperation and handling
Form 3B Formlabs 3D printer used to 3D print the self-printed parts of the TD drive
Gold pins (small) Neuralynx, Inc. 9885 Attachment of electorde wires to EIB board
Ground wire Science Products GmbH SS-3T/A
High-density connector  LabMaker GmbH/Omnetics A79026-001
Lister Hodded rats Charles River Laboratories Crl:LIS we used male rats, 9-12 weeks of age at arrival
M1 brass insert AliExpress Commercially available https://aliexpress.com/item/33047616164.html
M1 tap McMaster 2504A33
M1x16 screw Bossard 1096613
M1x3 stainless steel screws  Screws and More 84213_14985
M2.5×5 polyimide screws Screws and more 7985PA25S_50
mineral oil McMaster 1244K14
Nail polish Etos Commercially available For color coding EEG and GND wires
painter's tape Gamma Commercially available For wire bundle preperation
Pin vise McMaster 8455A16
plotting paper Canson Commercially available For wire bundle preperation
polyimide tubes Amazon / Small Parts TWPT-0159-30-50 AWG, 0.0159" ID, 0.0219" OD, 0.0030" Wall, 30" Length
RHD 32-channel headstage with accelerometer Intan Technologies, LLC C3324 For tethered recordings in the sleepbox
RHD 3-ft (0.9 m) standard SPI cables Intan Technologies, LLC C3203 From commutator to headstage
RHD 6-ft (1.8 m) standard SPI cables Intan Technologies, LLC C3206 From OpenEphys box to commutator
Slip Ring with Flange Adafruit 1196 Commutator: 22 mm diameter, 12 wires
Solder flux  Griffon S-39 50 ml Commercially available For soldering EEG & GND screws
soldering paste Amazon B08CBZ5HC5
stainless steel M2 nut  McMaster 93935A305
Tethered recording setup  OpenEphys Acquasition Board
Wireless recording logger SpikeGadgets miniLogger 32 For wireless recordings in the task
Wireless recording setup SpikeGadgets Main Control Unit (MCU) incl. breakout board and RF transceiver For wireless recordings in the task

Referencias

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Schröder, T., van der Meij, J., van Heumen, P., Samanta, A., Genzel, L. The TD Drive: A Parametric, Open-Source Implant for Multi-Area Electrophysiological Recordings in Behaving and Sleeping Rats. J. Vis. Exp. (206), e66457, doi:10.3791/66457 (2024).

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