Echtzeit-cAMP-Dynamik in lebenden Zellen mit dem fluoreszierenden cAMP-Differenzdetektor in situ

Adenosin-3′,5′-cyclisches Monophosphat, cAMP, spielt eine zentrale Rolle bei der zellulären Kommunikation und der Koordination verschiedener physiologischer Prozesse. cAMP fungiert als zweiter Botenstoff, der externe Signale von Hormonen, Neurotransmittern oder anderen extrazellulären Molekülen weiterleitet, um eine Kaskade intrazellulärer Ereignisse zu initiieren¹. Darüber hinaus ist cAMP an verschiedenen Signalwegen beteiligt, einschließlich solcher, die mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) und Adenylylcyclasen assoziiert sind. Das Verständnis der Rolle von cAMP bei der zellulären Signalübertragung ist von grundlegender Bedeutung, um die komplexen Mechanismen zu entschlüsseln, die normalen zellulären Funktionen zugrunde liegen, und um potenzielle Therapien für eine Vielzahl von Erkrankungen^{zu entwickeln 2}.

In der Vergangenheit wurden verschiedene Methoden eingesetzt, um cAMP direkt oder indirekt zu messen. Dazu gehörten die Radiomarkierung von zellulären ATP-Pools, gefolgt von der Säulenreinigung, HPLC, Radioimmunoassays und enzymgebundenen Immunoassays ^1,2. Diese Legacy-Assays sind durch die Tatsache eingeschränkt, dass es sich um Endpunktmessungen handelt, die eine große Anzahl von Proben erfordern, um zeitabhängige Reaktionen zu erstellen. In jüngerer Zeit wurden FRET-Sensoren (Fluorescence Resonance Energy Transfer) entwickelt, um Assays in lebenden Zellen zu erstellen, dynamische Echtzeitdaten zu erzeugen und Sensoren an verschiedenen subzellulären Orten anzuvisieren³. FRET nutzt zwei Fluorophore, einen Fluoreszenzdonor und einen Fluoreszenzakzeptor, so dass das Akzeptorfluorophor in unmittelbarer Nähe durch den Donorfluoreszenzausgang angeregt wird, wenn er sich in unmittelbarer Nähe befindet. Die beiden am häufigsten verwendeten Fluorophore sind das cyanfluoreszierende Protein (CFP) und das gelb fluoreszierende Protein (YFP), da diese kompatible Anregungs- und Emissionseigenschaften aufweisen. Neben CFP und YFP wird die Verwendung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) und des rot fluoreszierenden Proteins (RFP) häufig für FRET-Biosensoren verwendet. cAMP FRET-Biosensoren funktionieren, indem sie einen Donor und einen Akzeptor an gegenüberliegenden Enden des Epac2 cAMP-Bindungsproteins haben. Die cAMP-Bindung verändert die Bestätigung von EPAC und vergrößert den Abstand zwischen Donor- und Akzeptorfluorophoren ^3,4. Diese Konformationsänderung wird durch einen Verlust von FRET nachgewiesen, d. h. durch die Anregung des Akzeptorfluorophors durch Energie, die von den Donorfluorophortropfen³ übertragen wird. Obwohl es sich um einen scheinbar einfachen Prozess handelt, gibt es eine Fülle von Einschränkungen und Problemen mit dem FRET-Biosensor für die cAMP-Forschung⁵. Eine davon ist die Auswahl von fluoreszierenden Proteinen, z. B. GFP, die auf natürliche Weise dimerisieren können, wodurch die Empfindlichkeit verringert^{wird 6}. FRET-basierte cAMP-Biosensoren wurden auf bestimmte Mikrodomänen^{ausgerichtet 7}, aber es kann aufgrund der Größe eines Konstrukts mit zwei Fluorophoren⁶ Einschränkungen geben. Ein weiteres wichtiges Problem ist das niedrige Signal-Rausch-Verhältnis von FRET-Signalen, das sich aus der Überlappung zwischen Anregung und Emission des Fluorophors ergibt, was zu einer hohen Abtastfrequenz führt und die Analyse der Ergebnisse erschwert ^4,5.

Zuletzt hat der neuartige Biosensor (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis, diese und andere Einschränkungen bei der Untersuchung der Regulation der cAMP-Signalübertragung gelöst⁸. Eine wichtige Verbesserung ist die Abhängigkeit von einem einzigen Fluorophor. Dies ermöglicht ein schnelles und effizientes Signal mit einem größeren Dynamikbereich und einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Infolgedessen kann die Genauigkeit höher sein, da es einen weniger breiten Bereich von Wellenlängen gibt, die durchkämmt^{werden müssen 8}. Wie FRET-Sonden wurde der Biosensor auf subzelluläre Stellen ausgerichtet, was die Erforschung der Kompartimentierungstheorie und die Erforschung von Lipid-Rafts und Nicht-Rafts sowie anderen subzellulären Domänen ermöglicht⁹. Am wichtigsten ist vielleicht die Eignung eines einzelnen Fluorophor-Biosensors für das Hochdurchsatz-Screening, der die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit im Vergleich zu FRET-basierten Biosensoren verbessert hat. Der Biosensor ist in einen BacMam-Vektor verpackt, der eine einfache Transduktion einer Vielzahl von Zelltypen und eine präzise Kontrolle der Proteinexpression ermöglicht.

Die Expressionskontrolle über den BacMam-Vektor kann besonders bei Assays mit GPCR-Orthologen verschiedener Spezies nützlich sein, um die Interpretation von Daten aus Tierversuchen zu erleichtern. Darüber hinaus ist die Kontrolle über die Rezeptorexpression entscheidend für die Messung der verschiedenen Grade der Arzneimittelwirksamkeit (z. B. inverse Agonisten und partielle Agonisten), und niedrige Rezeptorexpressionsniveaus sind nützlich, um die niedrigen Niveaus in tierischem Gewebe nachzuahmen. BacMam ist ein Baculovirus-Vektor, der modifiziert wurde, um Säugetierzellen wie primäre Zellkulturen und HEK-293-Linien zu transduzieren¹⁰. Dominante selektierbare Marker ermöglichen es BacMam, eine höhere Stabilität als herkömmliche Plasmidinfektionen zu bieten¹¹. Solche selektiven Promotoren ermöglichen eine effizientere Genübertragung und -expression. Darüber hinaus erhöht die Zugabe von Trichostatin A (einem Histon-Deacetylase-Hemmer) den Reporterproteinspiegel¹¹. Die Expressionsniveaus können über den Titer des verwendeten BacMam-Virus gesteuert werden und sollten für jeden Zelltyp optimiert werden. Im Falle dieses Biosensors ist ein rot oder grün fluoreszierendes Protein an den N- und C-Termini mit dem Epac verknüpft. Wenn cAMP bindet, bewegt eine Konformationsänderung im Biosensor Aminosäuren in die Nähe des fluoreszierenden Proteins. Eine solche Verschiebung verschiebt die Absorption vom anionischen Zustand in den neutralen Zustand bei 400 nm, wodurch die Fluoreszenz verringert wird.

Es gibt 90-120 GPCRs, die in einer einzigen Zelle exprimiert werden und auf eine Vielzahl von neurohumoralen Signalen reagieren¹². Daher kann die Hypothese aufgestellt werden, dass mindestens mehrere Dutzend GPCRs pro Zelle cAMP durch Gs- bzw. Gi-Kopplung stimulieren oder hemmen können. Während es Fortschritte bei der Überwachung dieses zweiten Botenstoffs in Echtzeit gibt, wie z. B. FRET, sind effizientere Methoden erforderlich. Die Methodik zur Überwachung der Synthese und Degradation von cAMP-Signalen mit cADDis in Echtzeit wird hier vorgestellt. Die Änderung der Fluoreszenz kann in Echtzeit mit einem Fluoreszenzplatten-Reader für Hochdurchsatz-Assays oder mit einem Fluoreszenzmikroskop für Einzelzell-Assays überwacht werden. Diese Methoden sind nützlich für eine Vielzahl biologischer Fragestellungen zur GPCR-Signalübertragung über cAMP.