Un modelo murino de insuficiencia cardíaca inducida por hiperlipidemia con fracción de eyección preservada

El protocolo animal fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Miami, de conformidad con las directrices del Instituto Nacional de Salud (NIH) (protocolo IACUC 23-103-ad03). Para el presente estudio, se adquirieron ratones de tipo salvaje (WT) con fondo 129J de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales) y se criaron internamente. Todos los ratones eran compañeros de camada en el fondo 129J. Los experimentos incluyeron ratones machos y hembras. El ratón LDLR/P-407 HFpEF se estableció administrando una dosis única de AAV9-cTnT-LDLR en la primera semana y p407 quincenal durante cuatro semanas. 1. Preparación y administración de AAV9-cTnT-LDLR NOTA: El plásmido AAV9-cTNT-hLDLR (ver Tabla de Materiales) codifica la proteína LDLR humana completa (2664bp) (Figura 1). Preparación de vectores virales AAV-LDLREn función del número de animales, descongele los viales de AAV9 en hielo durante 20 minutos, luego diluya las partículas de AAV en solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco para obtener una concentración de 1 x 1012 genomas vectoriales/ratón en 100 μL. Coloque la solución viral en una aguja de 28-30 g en una jeringa de 1 ml. Tenga cuidado de evitar que entren burbujas de aire en la aguja. Procedimientos de inyección intravenosa (i.v.) en la vena de colaEncienda el oxígeno hasta 0,5 L/min y ajuste el sistema de anestesia de isoflurano al 4%-5%. Coloque el ratón en la cámara de inducción durante ~ 2 minutos, hasta que el animal no responda. Coloque al animal en un retenedor iluminador de cola de ratón (por ejemplo, Braintree Scientific, Inc. (Braintree, MA)) y acomode al animal acostado de lado. Use anestesia con isoflurano al 2%-3% para el mantenimiento.NOTA: El calentamiento por el dispositivo de restricción causará la dilatación de la vena de la cola de los ratones y, por lo tanto, facilitará significativamente la inyección. Identifica la vena lateral de la cola. Limpie el área de inyección con un antiséptico usando una gasa. Sostén el extremo de la cola para extenderla, y masajea la cola del ratón con los dedos hasta visualizar la vena. Inserte la aguja en un ángulo bajo (ángulo de 10-15 grados) e inyecte 100 μL de AAV diluido en la vena de la cola (Figura 2A). Retire la aguja y aplique presión inmediatamente con un dedo hasta que se detenga el sangrado. Devuelve el ratón a la jaula original. 2. Preparación y administración del P-407 Preparación del P-407Prepare la solución diluyendo el agente P-407 (consulte la Tabla de materiales) con DPBS hasta una concentración final de 100 mg/mL dentro de una campana extractora. Refrigere la solución a 4 °C durante la noche en un rotador para facilitar la disolución del P-40710. Procedimiento quincenal de inyección intraperitoneal (i.p.)Pesar cada ratón el primer día de las inyecciones de i.p. Utilizando la fórmula 1 g/kg, calcule la dosis adecuada para cada ratón en función de los pesos y las jeringas de precarga. Debajo de una campana extractora, sujete manualmente el ratón con la cabeza y el cuerpo inclinados hacia abajo para reposicionar los órganos internos cranealmente. Esta técnica evita la punción de estructuras vitales en las proximidades. Identificar la cavidad peritoneal izquierda en el cuadrante inferior del abdomen, lateral a la línea media. Limpie el sitio con un antiséptico. En un ángulo de 45 grados o menos, inserte la aguja en la cavidad peritoneal (Figura 2B). Aspire la jeringa para asegurar una inserción adecuada. Si hay sangre o tejido en la aspiración, retire la aguja y repita los pasos 2.2.2 -2.2.4 hasta que la jeringa esté limpia. Deseche la aguja en el recipiente apropiado para objetos punzantes y devuelva el ratón a la jaula original. 3. Valoración ecocardiográfica PreparaciónAplique la crema depilatoria en el pecho y la parte superior del abdomen del ratón el día anterior o varias horas antes de la toma de imágenes. Retire la crema con una gasa húmeda después de 2 minutos. Anestesiar al ratón con isoflurano al 2,5%-3,0% a un caudal de 0,8 L/min y mantener con isoflurano al 1%-1,5%. A continuación, fije el ratón a la plataforma adecuada en posición supina con las patas sobre almohadillas de electrodos con gel conductor y cubra la nariz y la boca con un cono nasal para garantizar la anestesia continua con isoflurano. Vista paraesternal de eje largoCon el ratón colocado en posición supina, incline el lado derecho de la plataforma 45 grados. A continuación, alinee diagonalmente la sonda del transductor en el sistema de rieles, inclinándola 30-40 grados en el sentido de las agujas del reloj desde la extremidad superior derecha hasta el abdomen izquierdo para obtener y almacenar imágenes en modo B. Analice las imágenes en modo B utilizando un software de análisis de ultrasonido (consulte la tabla de materiales) para obtener la fracción de eyección (Figura 3A). Vista paraesternal de eje cortoGire la sonda del transductor en el sistema de rieles 90 grados en el sentido de las agujas del reloj para obtener y almacenar imágenes en modo B y modo M. Vista apicalIncline la esquina superior izquierda de la plataforma hacia abajo y hacia la derecha. Oriente el transductor hacia el hombro derecho del animal. Visualiza la válvula mitral en modo B y modo Doppler color. Adquirir y almacenar imágenes Doppler de ondas pulsadas (PW) y Doppler tisular5. Analice las imágenes de PW Doppler y Doppler tisular utilizando el software de análisis de ultrasonido para obtener el IVRT, E/E’ y E/A (Figura 3B-E). 4. Registro de datos de bucle de presión-volumen (PV) Realizar análisis hemodinámicos al final del estudio para evaluar la función sistólica y diastólica del ventrículo izquierdo (VI), siguiendo el procedimiento descrito anteriormente11,12.Comience por inducir al ratón con isoflurano (3-5%, cámara de inducción). Cuando se inicie la acción anestésica, transfiera al animal al banco quirúrgico y mantenga la anestesia con isoflurano (1-3%, mascarilla). Hacer una pequeña incisión en la piel sobre el cuello para permitir la intubación endotraqueal (a través de la boca). Ventile al animal con una mezcla de oxígeno e isoflurano utilizando un ventilador para roedores (por ejemplo, Micro vent modelo 848, Harvard Apparatus) ajustado a un volumen de ~0,15-0,2 mL y la frecuencia respiratoria a 120-170 respiraciones/min. Controle la temperatura corporal a ~37 °C ± 1 °C durante todo el procedimiento utilizando una mesa quirúrgica con temperatura controlada. Exponer y canular la vena yugular interna izquierda con una aguja de 30 G para la administración de líquidos. Corta la piel sobre el sitio del cuello ventral mediano y expone la arteria carótida. Después de la oclusión de la porción distal de la arteria carótida derecha, se debe hacer una pequeña incisión en la arteria para permitir la introducción de un catéter de presión-volumen (PV) con micropunta (ver Tabla de materiales) en el ventrículo izquierdo (abordaje torácico cerrado). Registre los bucles PV durante el estado estacionario y la oclusión de la vena cava inferior. Al final del experimento, eutanasia humanitaria del animal (bajo anestesia profunda) utilizando un método AVMA aprobado (por ejemplo, isoflurano seguido de dislocación cervical). Analice los datos fotovoltaicos utilizando el software LabChart (consulte la Tabla de Materiales) y calibre los volúmenes utilizando mediciones ecocardiográficas.