قياس كمية الطعام في Caenorhabditis elegans عن طريق قياس التخليص البكتيري
Summary
يصف هذا البروتوكول مقايسة لتحديد معدل تغذية Caenorhabditis elegans بناء على قياس إزالة البكتيريا في الثقافة السائلة.
Abstract
التغذية عملية حيوية أساسية لنمو الكائن الحي وتكاثره وبقائه. يهدف هذا الفحص إلى قياس المدخول الغذائي من Caenorhabditis elegans (C. elegans) ، وهي معلمة مهمة عند دراسة علم الوراثة للشيخوخة أو التمثيل الغذائي. في معظم الأنواع ، يتم تحديد التغذية عن طريق قياس الفرق بين كمية الطعام المقدمة والكمية المتبقية بعد فترة زمنية معينة. تستخدم الطريقة المعروضة هنا نفس الإستراتيجية لتحديد تغذية C. elegans. يقيس كمية البكتيريا ، مصدر الغذاء ل C. elegans ، التي تم تطهيرها في غضون 72 ساعة. تستخدم هذه الطريقة 96 لوحة عيار ميكرو جيدا وسمحت بفحص مئات الأدوية لقدرتها على تعديل تناول الطعام بسرعة وعمق غير ممكنين في النماذج الحيوانية الأخرى. تكمن قوة هذا الفحص في أنه يسمح بقياس التغذية والعمر في وقت واحد ويقيس بشكل مباشر اختفاء الطعام ، وبالتالي فهو يعتمد على نفس المبادئ المستخدمة للكائنات الحية الأخرى ، مما يسهل المقارنة بين الأنواع.
Introduction
تم استخدام Caenorhabditis elegans على نطاق واسع في أبحاث الشيخوخة. لقد كان نموذجا قويا لدراسة علم الوراثة الكامن وراء طول العمر بوساطة التمثيل الغذائي الناجم عن تقييد النظام الغذائي ، أو انخفاض نشاط الميتوكوندريا ، أو انخفاض إشارات الأنسولين. 1،2،3،4،5،6،7. ومع ذلك ، فقد ثبت أن قياس التغذية في سياق طول العمر صعب بالنسبة ل C. elegans بسبب صغر حجم3،8،9،10،11،12،13،14،15.
التغذية هي سلوك بيولوجي أساسي مطلوب للبقاء على قيد الحياة ، ويكمن تنظيمها الصارم في صميم الحفاظ على صحة التمثيل الغذائي والتكاثر والشيخوخة. يتم التحكم في سلوك التغذية من خلال مسارات إشارات متعددة في كل من الجهاز العصبي والمحيط ، وبالتالي ، لا يمكن دراستها إلا في الجسم الحي16،17،18،19. تمثل التغذية الركيزة الأولى من ثلاث ركائز: (أ) استهلاك الطاقة، (ب) تخزين الطاقة، (ج) إنفاق الطاقة الذي يحكم توازن طاقة الكائن الحي. تم فحص التغذية في C. elegans بشكل رئيسي عن طريق قياس ضخ البلعوم ، كما هو محدد من خلال معدل انقباضات البلعوم. قدم هذا النهج رؤى حاسمة حول سلوك تغذية C. elegans 3،4،8،12،13،20،21 ؛ ومع ذلك ، فإن ضخ البلعوم ، وخاصة الذي يقاس على فترات قصيرة من الدقائق ، لا يرتبط بالضرورة بتناول الطعام.
لا يتم تحديد تناول الطعام فقط من خلال معدل ضخ البلعوم ولكن أيضا من خلال معلمات مثل مدة وتواتر نوبات التغذية وكثافة بكتيريا الطعام. قد يكون للحيوان ضخ بلعومي مرتفع للغاية ، لكن طول نوبات التغذية قد يكون أقصر ، مما يعوض المعدل المتزايد. عامل مربك آخر هو الكفاءة التي قد يبتلع أو لا يبتلع الضخ البكتيريا وطحنها. مثال متطرف على فصل تناول الطعام عن ضخ البلعوم هو إضافة السيروتونين دون وجود أي طعام (بكتيريا). في وجود السيروتونين الخارجي ، تضخ بمعدل مرتفع ، ولكن بدون وجود بكتيريا ، لا يؤدي معدل الضخ المرتفع إلى تناول الطعام2،6،13،22،23.
تقيس طريقة التخليص البكتيري المعروضة هنا المدخول الغذائي لمجموعات الديدان في الآبار الفردية مع انخفاض تركيزات البكتيريا بمرور الوقت (الشكل 1). يشبه هذا النهج تلك المستخدمة في الأنواع الأخرى حيث يمثل اختفاء الطعام مقياسا لتناول الطعام10،11،24،25،26،27،28. في المنشور الأصلي ، تحققنا من صحة هذه الطريقة لقياس تناول الطعام عن طريق تغذية C. elegans بالبكتيريا ذات العلامات النظيرية 15N11. أظهرت المقاييس اللاحقة بواسطة قياس الطيف الكتلي أن قياس اختفاء البكتيريا يرتبط ارتباطا وثيقا بحدوث وضع العلامات على النظائر ، مما يكشف عن الامتصاص الفعلي للبكتيريا في11. وبالتالي ، نحن واثقون من أن مقايسة إزالة البكتيريا تمثل تناول الطعام في معظم الظروف. الغرض من الفحص ليس استبدال مقايسة ضخ البلعوم ولكن للإضافة إلى صندوق أدوات المقايسات لدراسة التغذية والتمثيل الغذائي في C. elegans وكيفية ارتباطها بالشيخوخة وطول العمر.
Protocol
Representative Results
Discussion
قدم البروتوكول مقاييس التخليص البكتيري كقراءة لتناول طعام C. elegans في 96 لوحة عيار ميكرويتر جيدا. تظهر منحنيات الجرعة والاستجابة في قسم النتائج التمثيلية أن الفحص يقيس كميا تناول الطعام ، وهي فكرة تم تأكيدها بشكل مستقل باستخدام البكتيريا الموسومة بالنظائر11. باستخدام هذا الفحص ، نجحنا في اختبار الأدوية المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية مثل مضادات الذهان ذات الآثار الجانبية الأيضية البشرية المعروفة وأظهرنا أن هذه الأدوية زادت من التغذية في C. elegans10,26. الفحص مفيد لدراسة علم الوراثة أو علم الصيدلة للتغذية ويضيف أداة جديدة لأبحاث C. elegans لدراسة التمثيل الغذائي. يوفر هذا الفحص طريقة منخفضة التكلفة لدراسة التغذية بطريقة قابلة للتطوير وصديقة للوقت ، وهو أمر غير ممكن في معظم الكائنات الحية الأخرى. يظهر عملنا على الأدوية المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء أن العديد من الآثار الجانبية التي تظهر في المرضى من البشر لوحظت أيضا في C. elegans ، مما يكشف عن الحفظ التطوري24،26،32.
الفحص محدود بتركيز البكتيريا التي يمكن قياسها ضمن النطاق الخطي لقياس OD600 . ونتيجة لذلك ، فإن عدد الديدان ومجموعة التركيزات البكتيرية التي يمكن فحصها محدودة. سيؤثر الكثير من الديدان على OD600 عن طريق استهلاك البكتيريا بسرعة كبيرة ، وبالتالي “أكل” تركيز البكتيريا من OD600 الخطي. في تجربتنا ، فإن التباين في التحضير البكتيري هو المعلمة الحاسمة التي تتسبب في اختلاف النتائج من تجربة إلى أخرى. لقد حاولنا دون جدوى تجميد دفعات كبيرة من البكتيريا أو استخدام البكتيريا المجففة بالتجميد. في هذه الحالات ، إما أن معدل التحلل الذاتي أصبح مرتفعا جدا ، أو أن البكتيريا كانت ذات جودة تبطئ تطور C. elegans . ومع ذلك ، لم تكن اختباراتنا شاملة ، وقد تكون هذه المشكلة قابلة للحل.
بشكل عام ، فإن معدل التحلل الذاتي للبكتيريا هو الأكثر صعوبة في السيطرة عليه ، ويمكن أن يسبب تقلبا كبيرا. وجدنا أن بعض الأدوية يمكن أن تزيد من معدل التحلل الذاتي إلى مستويات لا يمكن للفحص تحديد كمية الطعام بشكل موثوق. نظرا لأن معدل التحلل الذاتي يزداد بمرور الوقت في الفحص ، فإننا لم نقم بقياس تناول الطعام بعد اليوم 5 من مرحلة البلوغ. بحلول هذا العمر ، تكون البكتيريا ~ 10 أيام في الثقافة. لقياس تناول الطعام بعد اليوم 5 من مرحلة البلوغ ، يجب غسل البكتيريا القديمة واستبدالها بأخرى طازجة.
الفحص المقدم هو امتداد لمقايسة العمر الافتراضي القائمة على 96 بئرا على ألواح المعايرةالدقيقة 31. يتيح هذا المزيج قياس العمر وتناول الطعام في نفس السكان. في حين أن مقايسة إزالة البكتيريا المعروضة هنا لا تسمح بتحديد تناول الطعام على مدار حياة C. elegans بأكملها بسبب التحلل الذاتي البكتيري ، إلا أنها توفر بيانات قوية للأيام الأربعة الأولى من مرحلة البلوغ ، وهو الوقت الذي يحتوي على أعلى كمية غذائية. خاصة بالنسبة لاكتشاف الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة ، فإن التحكم في تناول الطعام أمر ضروري. باختصار ، نتوقع أن يكون الفحص المقدم مفيدا لمجتمع C. elegans وتوسيع مجموعة الأدوات لدراسة التمثيل الغذائي أو التحكم فيه في سياق دراسات الشيخوخة والعمر.
تخطيط:
قبل التخطيط لقياس تناول الطعام ، يجب مراعاة بعض الاعتبارات.
قتل البكتيريا:
نقتل البكتيريا عن طريق التشعيع بالأشعة السينية في أنبوب مخروطي سعة 50 مل (900 رمادي لمدة 4 ساعات مضبوط عند 160.0 كيلو فولت و 25.0 مللي أمبير). نستخدم RS2000 بواسطة Rad Source للتشعيع. اعتمادا على المعدات ، قد يختلف الوقت المحدد وجرعة الإشعاع من منشأة إلى أخرى. يجب تحديد القتل الكامل للبكتيريا عن طريق طلاء البكتيريا بعد التشعيع للكشف عن الناجين عن طريق النمو. من الضروري قتل جميع البكتيريا لمنع النمو أثناء الفحص ، لأن هذا سيؤدي إلى التقليل من قيمة التغذية أو حتى قيم التغذية السلبية. الأهم من ذلك ، يجب قتل البكتيريا حتى تظل C. elegans تأكله. في تجربتنا ، هناك ثلاث طرق لقتل كميات كبيرة من البكتيريا بشكل موثوق: (i) التشعيع بالأشعة السينية ، (ii) بالأشعة γ ، و (iii) إضافة الفورمالديهايد29,30. معدلات التحلل الذاتي بين هذه الطرق الثلاث قابلة للمقارنة ، مع معامل تباين بنسبة 8٪ بين معدلات التحلل الذاتي للتجارب الموضحة في الشكل 3 ب. كانت الطرق التي لم تنجح بشكل موثوق في أيدينا هي الأشعة فوق البنفسجية ، وكوكتيلات المضادات الحيوية ، وتعطيل الحرارة ، وأزيد الصوديوم. هذه الطرق إما تفشل في قتل البكتيريا تماما (الأشعة فوق البنفسجية والمضادات الحيوية) ، أو إنتاج البكتيريا التي لا تأكلها C. elegans (الحرارة) ، أو تغيير تناول الطعام (أزيد الصوديوم).
عدد النسخ المتماثلة:
في تجربتنا ، تكون التغييرات في التغذية صغيرة بشكل عام مقارنة بالتباين الملحوظ. وبالتالي ، فإن قياس التغيرات في تناول الطعام يتطلب عدة آبار متكررة. يوضح الشكل 2 أ ، ب 96 صفيحة بئر مصممة لأربعة أو ستة ظروف مختلفة ، مع 21 أو 14 بئرا مكررة وبئرين للتحكم في التحلل الذاتي بدون ديدان. بالنظر إلى التباين الكبير والتغييرات الصغيرة نسبيا المتوقعة ، تميل التغييرات 0.5-2.5 أضعاف في التغذية إلى أن تكون الحدود الدنيا والعليا. نوصي ب 14 إلى 21 بئرا مكررة لكل حالة وبئرين على الأقل للتحكم في التحلل الذاتي ، موصوفين أدناه. هذه التكرارات كافية لتوليد منحنيات كمية للجرعة والاستجابة للأدوية التي تغير التغذية11,26.
ضوابط التحلل الذاتي:
يقيس OD600 عدد الجسيمات في المحلول ، ومعظمها مستقل عن حجم الجسيمات. ومع ذلك ، فإن البكتيريا الميتة سوف تتحلل ، وتفقد طبيعتها الجسيمية. نسمي هذا التحلل الذاتي ، والذي يحدث بشكل مستقل في وجود الديدان ويخفض قياسات OD600 دون أن تأكل الديدان. يحدث التحلل الذاتي أثناء الفحص ويحتاج إلى قياسه بشكل مستقل في بئرين على الأقل لكل حالة. تتلقى هذه الآبار نفس المعاملة مثل الآبار الأخرى في نفس الحالة ، باستثناء أنها لا تحتوي على أي ديدان. وجدنا أن العديد من الأدوية يمكن أن تغير أيضا معدل تحلل الذات. وبالتالي ، فإن كل حالة تحتاج إلى آبار مستقلة للتحكم في التحلل الذاتي مع تركيز كل منها. يوضح الشكل 2 إعداد لوحة لأربعة أو ستة شروط مع جميع آبار التحكم في التحلل الذاتي في أسفل اللوحة في الصف H.
السكان المرجعيون N2:
لاحظنا أيضا أن الكمية المطلقة من البكتيريا المستهلكة يمكن أن تتقلب بين التجارب ، على الأرجح تتعلق بجودة البكتيريا. على الرغم من بذل قصارى جهدنا لإعدادها بنفس الطريقة تماما في كل مرة ، إلا أن هناك تقلبات. على سبيل المثال ، يمكن حصاد البكتيريا أثناء وجودها في حالة الانقسام خلال مرحلة النمو اللوغاريتمي ، وبالتالي تكون أكبر بكثير في الحجم من البكتيريا التي يتم حصادها في المرحلة الثابتة. وبالتالي ، يمكن أن تؤدي هذه الاختلافات البسيطة في حجم البكتيريا إلى تغييرات في عدد البكتيريا المستهلكة وقيم OD600 المختلفة لأن قياسات OD600 لا تميز بين الأحجام. لهذا السبب ، نقوم دائما بتضمين مجموعة واحدة من التحكم N2 غير المعالجة التي تعمل كقيمة مرجعية ، إما مضبوطة على 1 أو 100٪ ، لتحديد ما إذا كانت المجموعات التجريبية تأكل أكثر أو أقل من عنصر التحكم N2. تسمح هذه الممارسة بإجراء مقارنات بين التجارب ، حتى لو اختلفت قيم OD600 .
الفترات الزمنية:
يتطلب استخدام قيم OD600 لقياس تناول الطعام انخفاض تركيز البكتيريا بشكل ملموس. نظرا لأن حجم المزرعة أكبر بكثير من الديدان ، يجب أن تأكل كمية كبيرة من البكتيريا لإحداث فرق يمكن اكتشافه. يتطلب البقاء في النطاق الخطي لقيم OD600 أن يبقى تركيز البكتيريا بين ~ 1 مجم / مل و 10 مجم / مل بحيث يجب أن تختفي كمية كبيرة من البكتيريا لاكتشافها. تأكل الديدان أكثر من أواخر L4 إلى اليوم الرابع من مرحلة البلوغ بسبب إنتاج البيض. وبالتالي ، فإن هذا الفاصل الزمني مثالي. يمكن قياس فترات أقصر مثل 24 ساعة11 ، ولكن هذا أكثر صعوبة ويحتاج إلى ~ 40 بئرا لكل حالة. خيار آخر لقياس تناول الطعام من اليرقات هو مضاعفة عدد لكل بئر. ومع ذلك ، فإن المشكلة في هذا النهج هي أن الكثير من الديدان ستبدأ في التأثير على قراءات OD600 عندما تكبر.
حلول المخزون للأدوية المراد اختبارها:
إذا تم اختبار الأدوية مثل السيروتونين لقدرتها على تعديل التغذية ، ففكر في ما يلي عند إعداد حلول المخزون. نقوم بشكل عام بإعداد مخزون 50x للأدوية القابلة للذوبان في الماء وإضافة 3 ميكرولتر إلى كل بئر (1:50) ، ولكن تركيزات المخزون الأخرى (100x ، 300x) تعمل أيضا. ومع ذلك ، إذا تم تخفيف الأدوية في مذيبات أخرى غير الماء (على سبيل المثال ، DMSO) ، يجب ألا يتجاوز التركيز النهائي 0.5٪. سرعان ما تصبح المذيبات ضارة ب C. elegans. وبالتالي ، يجب أن تكون محاليل مخزون الأدوية المذابة في المذيبات العضوية مثل DMSO 300x أو أعلى.
تسجيل الديدان الحية والميتة:
يعتمد تحديد الحية والميتة على حركة الدودة. يستخدم الضوء القوي ، وخاصة الضوء الأزرق ، لأنه يتسبب في تحرك. علاوة على ذلك ، فإن تسجيل عدد لكل بئر سيكشف ما إذا كانت هناك وفيات زائدة. يمكن أن تحدث الوفيات الزائدة مع المواد السامة أو التركيزات العالية (>0.5٪) من العديد من المذيبات ، بما في ذلك DMSO. بشكل عام ، يجب أن يكون هناك أقل من 1: 100 (1٪) من الميتة. يمكن هز الأطباق لمدة 30 ثانية عند 800 دورة في الدقيقة على شاكر لوحة المعايرة الدقيقة إذا استقر الطعام وأصبح من الصعب حساب السكان. تجاهل الآبار مع الذكور أو أكثر من 16 دودة (انظر المشاكل).
المشاكل المحتملة:
اهتزاز غير كاف:
في الوسط السائل ، يمكن للبكتيريا أن تتجمع بسهولة معا وتستقر في قاع الآبار. في تجربتنا ، قد يفشل الاهتزاز لمدة تقل عن 20 دقيقة في تفتيت الكتل البكتيرية وإعادة تعليقها ، مما يتسبب في قياسات OD600 غير دقيقة. قياسات OD600 في وجود كتل بكتيرية ستقلل من تركيز البكتيريا. قد تتسبب إعدادات الاهتزاز المفرطة في التصاق السائل بمانع التسرب. بمجرد إزالة المادة المانعة للتسرب لقراءة OD600 ، سيؤدي السائل العالق في السدادة إلى قراءة OD600 أقل. إذا كان هناك سائل على السدادة ، فقم بتدوير اللوحة بسرعة منخفضة (500-1000 دورة في الدقيقة) ورجها مرة أخرى لمدة 5 دقائق. علاوة على ذلك ، تأكد ، كما هو مذكور في القراءات في اليوم 1 واليوم 4 ، من القراءة في غضون 10 دقائق من هز الأطباق لتجنب استقرار البكتيريا.
اختلاف قيم تناول الطعام المطلق بين التجارب:
على الرغم من بذل قصارى جهدنا لتوحيد المستحضرات البكتيرية ، إلا أنها غالبا ما تختلف بطرق تؤثر على تناول الطعام في الديدان. على سبيل المثال ، بسبب حالة تقسيمها ، تختلف البكتيريا في الحجم بناء على ما إذا كان قد تم حصادها في النمو اللوغاريتمي أو المرحلة الثابتة ، مع كون البكتيريا اللوغاريتمية أكبر. نظرا لعدم تمييز قياسات OD600 بين الأحجام ، فإن الاختلافات في حجم البكتيريا بسبب المرحلة التي تم فيها حصاد البكتيريا قد تؤدي إلى الاختلافات الواضحة التي لوحظت في تناول الطعام القاعدي بين المستحضرات البكتيرية. أفضل طريقة للمقارنة بين التجارب هي تضمين مجموعة تحكم N2 غير معالجة دائما وتطبيع النتائج مع مجموعة N2 هذه.
تأثيرات الازدحام:
التركيز البكتيري في هذا البروتوكول يكفي للحفاظ على OD600 في النطاق الخطي ل 2-16 دودة لكل بئر لمدة ~ 72 ساعة. اعتمادا على الدواء محل الاهتمام ، قد يستنفد البئر الذي يحتوي على أكثر من 16 دودة تركيز البكتيريا قبل القياس الثاني. وجدنا أيضا أن الآبار التي تحتوي على واحد تميل إلى أن تكون غير موثوقة. يفوق عامل التحلل ما تأكله دودة واحدة. وبالتالي ، فإن الأخطاء الطفيفة في تحديد عامل التحلل تؤثر بشكل غير متناسب على الآبار ذات عدد أقل من الديدان.
نوصي باستبعاد الآبار من التحليلات الإحصائية إذا تم استيفاء أحد الشروط أدناه. هناك ذكور في البئر (ليس لدينا بيانات تقارن تناول الطعام بين الذكور والخنثى) ؛ هناك أقل من 2 ديدان في البئر أو أكثر من 16 دودة في البئر ؛ ماتت الديدان في القراءة الثانية. أو إذا كان هناك ذرية في الآبار بسبب فشل FUdR. FUdR حساس للحرارة ويتم تعطيله حتى في درجات حرارة منخفضة تصل إلى 37 درجة مئوية. قم دائما بإذابة الثلج من FUdR في ماء بدرجة حرارة الغرفة.
قيم تناول الطعام السلبية:
تكون قيم تناول الطعام سلبية في بعض الأحيان ، مما يشير إلى المزيد من الطعام في اليوم 4 مقارنة باليوم 1. قد تشير قيم تناول الطعام السلبية إلى أحد العوامل التالية: ارتفاع معدل التحلل الذاتي ، ربما بسبب إضافة دواء يعمل على البكتيريا ، أو قيم تناول الطعام السلبية ، والتي قد تشير إلى أن البئر ملوثة وأن شيئا آخر غير الديدان ينمو. تزداد معدلات التحلل الذاتي أيضا مع تقدم البكتيريا في السن. لذلك ، نوصي باستخدام البكتيريا التي لا يزيد عمرها عن أسبوع. تمت إضافة دواء يترسب بمرور الوقت ، مما يؤثر على قيمة OD600 . قد يؤدي الاهتزاز غير الكافي في اليوم 1 إلى انخفاض قراءة OD600 بسبب الكتل البكتيرية. خضعت الديدان لإجهاد نقص الأكسجين. يحدث هذا عندما لا تكون نسبة السطح إلى الهواء كافية للسماح بتبادل الأكسجين. استخدم لوحة 96 بئرا المحددة في المواد ولا تتجاوز 150 ميكرولتر (120 ميكرولتر + 30 ميكرولتر من FUdR) لكل بئر. تحدد المسافة بين سطح البئر والقاع حيث تعيش الديدان تركيز الأكسجين.
القيود:
يقتصر هذا الفحص على الثقافة السائلة. لا يمكن تقييم سلوكيات التغذية التي لوحظت في الأطباق الصلبة ، مثل الانتقال داخل وخارج مروج الطعام ، باستخدام الفحص.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نريد أن نشكر Xiaolan Ye ، حيث تم تطوير هذا البروتوكول نتيجة لملاحظة قامت بها في الأصل. نشكر جميع الأعضاء السابقين والحاليين في مختبر Petrascheck على مساعدتهم في تطوير هذا البروتوكول وتحسينه. تم تمويل هذا العمل من قبل R21 AG080376 (إلى M.P.). تم توفير بعض السلالات من قبل CGC ، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440).
Materials
| Amphotericin B | RPI | A40030-0.1 | solvent: EtOH |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP176025 | solvent: water |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | use to make NGM plates |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | 46-100-RG | solvent: water |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40 µm to remove adults |
| Cholesterol | MP Biomedicals | 02101380-CF | 5 mg/mL stock |
| Difco, Agar, Bacteriological | BD Biosciences | 214510 | use to make NGM plates |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich | F0503 | to sterilize worms on L4 |
| Luria Broth | RPI | L24045-1000.0 | open capsule, mix with 1 L of water, autoclave |
| M9 Buffer | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 3 g KH2PO4 (FW: 136) 5 g NaCl (FW: 58), 0.25 g MgSO4*7H2O (FW: 246) autoclave |
|
| Microplate Sealer | Fisher Scientific | 236707 | |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Plate 96-well | Falcon | 351172 | |
| Plate reader | Tecan | 30016056 | use 600 nm filter lens |
| Potassium Citrate, 1 M , pH 6 | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 268.8 g Potassium citrate tribasic monohydrate (FW: 324) 26.3 g citric acid monohydrate (FW: 210) 900 mL of dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave |
|
| Potassium Phosphate, 1 M , pH 6 | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 136 g KH2PO4 (FW: 136) 900 mL dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave |
|
| S-Basal | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 5.9 g NaCl (FW: 58) 50 mL 1 M potassium phosphate (pH 6) add 900 mL dH2O autoclave, cool to 55 °C |
|
| S-Complete | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: Add to 1 L of S-basal (cooled to 55 °C or RT) 10 mL of 1 M potassium citrate pH 6, 10 mL of trace metal solutions 3 mL of 1 M CaCl2 3 mL of 1 M MgSO4 |
|
| Serotonin hydrochloride | Thermo Scientific | AAB2126309 | used at 5 mM |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653-5KG | to make buffers and NGM plates |
| Terrific Broth | Thermo Scientific | J75856-A1 | 12.5 g in 250 mL of water, autoclave |
| Titer plate Shaker | Thermo Scientific | 88880023 | shaken at 800 rpm, depends on shaker |
| Trace Metals Solution | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 1.86 g Na2EDTA (FW: 372.24) 0.69 g FeSO4*7H2O (FW: 278) 0.20 g MnCl2*4H2O (FW: 198) 0.29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287) 0.016 g CuSO4 (FW: 158) autoclave wrap in aluminum foil to keep in the dark |
|
Referencias
- Taormina, G., Mirisola, M. G. Calorie restriction in mammals and simple model organisms. Biomed Res Int. 2014, 308690 (2014).
- Cunningham, K. A., et al. Amp-activated kinase links serotonergic signaling to glutamate release for regulation of feeding behavior in C. elegans. Cell Metab. 16 (1), 113-121 (2012).
- You, Y. J., Kim, J., Raizen, D. M., Avery, L. Insulin, cgmp, and tgf-beta signals regulate food intake and quiescence in C. elegans: A model for satiety. Cell Metab. 7 (3), 249-257 (2008).
- Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans. Genética. 141 (4), 1399-1406 (1995).
- Apfeld, J., Kenyon, C. Cell nonautonomy of C. elegans daf-2 function in the regulation of diapause and life span. Cell. 95 (2), 199-210 (1998).
- Srinivasan, S. Neuroendocrine control of lipid metabolism: Lessons from C. elegans. J Neurogenet. 34 (3-4), 482-488 (2020).
- Calculli, G., et al. Systemic regulation of mitochondria by germline proteostasis prevents protein aggregation in the soma of. elegans. Sci Adv. 7 (26), eabg3012 (2021).
- Avery, L. The genetics of feeding in Caenorhabditis elegans. Genética. 133 (4), 897-917 (1993).
- Wu, Z., et al. Dietary restriction extends lifespan through metabolic regulation of innate immunity. Cell Metab. 29 (5), 1192-1205.e8 (2019).
- Chen, A. L., et al. Pharmacological convergence reveals a lipid pathway that regulates C. elegans lifespan. Nat Chem Biol. 15 (5), 453-462 (2019).
- Gomez-Amaro, R. L., et al. Measuring food intake and nutrient absorption in Caenorhabditis elegans. Genética. 200 (2), 443-454 (2015).
- Mckay, J. P., Raizen, D. M., Gottschalk, A., Schafer, W. R., Avery, L. Eat-2 and eat-18 are required for nicotinic neurotransmission in the Caenorhabditis elegans pharynx. Genética. 166 (1), 161-169 (2004).
- Hobson, R. J., et al. Ser-7, a Caenorhabditis elegans 5-ht7-like receptor, is essential for the 5-ht stimulation of pharyngeal pumping and egg laying. Genética. 172 (1), 159-169 (2006).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: Comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Webster, C. M., et al. Genome-wide rnai screen for fat regulatory genes in C. elegans identifies a proteostasis-ampk axis critical for starvation survival. Cell Rep. 20 (3), 627-640 (2017).
- Reis Rodrigues, P., et al. Synthetic ligands of cannabinoid receptors affect dauer formation in the nematode Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 6 (6), 1695-1705 (2016).
- Levichev, A., et al. The conserved endocannabinoid anandamide modulates olfactory sensitivity to induce hedonic feeding in C. elegans. Curr Biol. 33 (9), 1625-1639.e4 (2023).
- Wang, D., et al. Genetic behavioral screen identifies an orphan anti-opioid system. Science. 365 (6459), 1267-1273 (2019).
- Cheong, M. C., Artyukhin, A. B., You, Y. J., Avery, L. An opioid-like system regulating feeding behavior in C. elegans. Elife. 4, e06683 (2015).
- Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13091-13096 (1998).
- Huang, C., Xiong, C., Kornfeld, K. Measurements of age-related changes of physiological processes that predict lifespan of Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (21), 8084-8089 (2004).
- Witham, E., et al. C. elegans body cavity neurons are homeostatic sensors that integrate fluctuations in oxygen availability and internal nutrient reserves. Cell Rep. 14 (7), 1641-1654 (2016).
- Hussey, R., et al. Oxygen-sensing neurons reciprocally regulate peripheral lipid metabolism via neuropeptide signaling in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 14 (3), e1007305 (2018).
- Zapata, R. C., et al. Adipocytes control food intake and weight regain via vacuolar-type h(+) atpase. Nat Commun. 13 (1), 5092 (2022).
- Clay, K. J., Yang, Y., Clark, C., Petrascheck, M. Proteostasis is differentially modulated by inhibition of translation initiation or elongation. Elife. 12, e76465 (2023).
- Perez-Gomez, A., et al. A phenotypic caenorhabditis elegans screen identifies a selective suppressor of antipsychotic-induced hyperphagia. Nat Commun. 9 (1), 5272 (2018).
- Zapata, R. C., Zhang, D., Chaudry, B., Osborn, O. Self-administration of drugs in mouse models of feeding and obesity. J Vis Exp. (172), 62775 (2021).
- Zapata, R. C., et al. Targeting clic1 for the treatment of obesity: A novel therapeutic strategy to reduce food intake and body weight. Mol Metab. 76, 101794 (2023).
- Stuhr, N. L., Curran, S. P. Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C. elegans. Commun Biol. 3 (1), 653 (2020).
- Stuhr, N. L., Curran, S. P. Different methods of killing bacteria diets differentially influence Caenorhabditis elegans physiology. MicroPubl Biol. 2023, (2023).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (49), (2011).
- Wofford, M. R., King, D. S., Harrell, T. K. Drug-induced metabolic syndrome. J Clin Hypertens (Greenwich). 8 (2), 114-119 (2006).
