Describimos un ensayo fluorescente que puede confirmar de forma rápida y económica la capacidad de nuevos compuestos para quelar el hierro. El ensayo mide la capacidad de los compuestos para superar la actividad de unión al hierro de la sonda fluorescente quelante de hierro débil Calceína, lo que resulta en un aumento cuantificable de la fluorescencia cuando se produce la quelación.
Las células cancerosas requieren grandes cantidades de hierro para mantener su proliferación. El metabolismo del hierro se considera un sello distintivo del cáncer, lo que hace que el hierro sea un objetivo válido para los enfoques anticancerígenos. El desarrollo de nuevos compuestos y la identificación de pistas para su posterior modificación requiere que se lleven a cabo ensayos de prueba del mecanismo. Hay muchos ensayos para evaluar el impacto en la proliferación; Sin embargo, la capacidad de quelar el hierro es una medida importante y a veces pasada por alto debido a los altos costos del equipo y al desafío de cuantificar rápida y reproduciblemente la fuerza de la quelación. Aquí, describimos un método fluorescente sin células cuantificable y económico para confirmar la capacidad de nuevos compuestos para quelar hierro. Nuestro ensayo se basa en el colorante fluorescente barato Calceína, disponible en el mercado, cuya fluorescencia se puede cuantificar en la mayoría de los lectores de placas fluorescentes de microtitulación. La calceína es un quelante débil del hierro, y su fluorescencia se apaga cuando se une al Fe2+/3+; la fluorescencia se restablece cuando un nuevo quelante supera a la calceína por el Fe2+/3+ unido. La eliminación del enfriamiento fluorescente y el aumento resultante de la fluorescencia permite determinar la capacidad de quelación de un nuevo quelante putativo. Por lo tanto, ofrecemos un ensayo económico y de alto rendimiento que permite la detección rápida de nuevos compuestos quelantes candidatos.
Los cambios fenotípicos en las células que se relacionan con el desarrollo del cáncer a través de un conjunto común de capacidades biológicas alteradas ahora se conocen comúnmente como las características distintivas del cáncer. Entre ellos se encuentran los cambios resultantes de la reprogramación del metabolismo energético, que están muy extendidos en la biología de las célulascancerosas 1. Dicha reprogramación metabólica incluye un mayor requerimiento de hierro para apoyar la rápida proliferación y el crecimientotumoral 2. Esta sed de hierro conduce a un metabolismo del hierro desregulado, que en sí mismo se considera un sello distintivo del cáncer 3,4, con una desregulación que ocurre en todas las etapas5. Las características distintivas de la metástasis, propuestas más recientemente por Welch y Hurst, incluyen un papel para el hierro6, ya que el hierro puede inducir estrés oxidativo, y esto puede, a su vez, mediar cambios en el genoma, el epigenoma y el proteoma, aumentando la posibilidad de metástasis7. La relación entre los niveles de hierro y una mayor incidencia de cáncer ha sido demostrada a través de estudios epidemiológicos8.
Dado que las células cancerosas requieren grandes cantidades de hierro, son susceptibles a la deficiencia de hierro y, por lo tanto, a la quelación del hierro. Recientemente hemos publicado un artículo de revisión que destaca el potencial de la quelación del hierro para revertir varias características distintivas del cáncer a través de NDRG1 que interrumpe las vías de señalización oncogénica9. Sin embargo, el uso de la quelación del hierro como terapia oncológica independiente no ha arrojado resultados positivos en los ensayos clínicos debido a su toxicidad, su corta vida media, su rápido metabolismo y sus nuevos mecanismos de resistencia. Sin embargo, los quelantes de hierro se han mostrado prometedores en investigaciones in vitro e in vivo , lo que indica que se necesita más trabajo para desarrollar quelantes de hierro efectivos para la terapia del cáncer. La quelación específica del hierro es una estrategia validada en el descubrimiento de fármacos contra el cáncer, pero hasta la fecha solo se han descrito unas pocas clases10.
La identificación y caracterización de nuevos quelantes de hierro requiere la capacidad de medir su efecto en varios criterios de valoración. Muchos de ellos (como la proliferación, la apoptosis, la formación de especies reactivas de oxígeno) se miden de forma rutinaria y han sido esbozados y revisados en la literatura como métodos para evaluar las características distintivas del cáncer11. Al evaluar un nuevo quelante de hierro, muchos grupos examinan rutinariamente el efecto sobre las actividades antiproliferativas y redox, así como los efectos sobre la afluencia o el flujo de hierro. Las técnicas de predicción in silico 12 aumentan aún más la creciente reserva de quelantes de hierro que se pueden analizar.
La creación dequelantes de hierro requiere la capacidad de medir su efecto sobre los niveles de hierro como un medio para demostrar efectivamente la prueba de principio. Actualmente, el método más común para hacerlo es la citometría de flujo13 , que es costosa, requiere mucho tiempo y es poco cuantificable. La elección del ensayo a menudo se basa en la disponibilidad de equipo experimental, la velocidad y el costo de un ensayo. Por lo tanto, la capacidad de quelar el hierro puede ser una medida final que se pasa por alto debido a los altos costos de los equipos y al desafío de cuantificar rápida y reproduciblemente la fuerza de la quelación. Aquí, describimos un método fluorescente libre de células cuantificable y económico para confirmar la capacidad de nuevos compuestos para quelar hierro.
La excesiva dependencia de los cánceres del hierro para alimentar su metabolismo hace que la quelación del hierro sea una adición potenciala los regímenes terapéuticos. Sin embargo, existe una capacidad limitada para detectar rápidamente nuevos quelantes de iones metálicos por su capacidad para unirse a iones de hierro. Se sabe que la sonda fluorescente Calceína, de uso común y ampliamente disponible, actúa como un quelante débil de hierro y la unión d…
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a la Universidad de Northumbria por su apoyo.
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 215406 | other wise known as FAS |
Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
Deferiprone | Sigma-Aldrich | 379409 | |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | magnesium and calcium free |
Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma-Aldrich | M0812 | any optically transparent 96 well plate will work |