Summary

Método fluorescente sin células, cuantificable y económico, para confirmar la capacidad de nuevos compuestos para quelar el hierro

Published: February 23, 2024
doi:

Summary

Describimos un ensayo fluorescente que puede confirmar de forma rápida y económica la capacidad de nuevos compuestos para quelar el hierro. El ensayo mide la capacidad de los compuestos para superar la actividad de unión al hierro de la sonda fluorescente quelante de hierro débil Calceína, lo que resulta en un aumento cuantificable de la fluorescencia cuando se produce la quelación.

Abstract

Las células cancerosas requieren grandes cantidades de hierro para mantener su proliferación. El metabolismo del hierro se considera un sello distintivo del cáncer, lo que hace que el hierro sea un objetivo válido para los enfoques anticancerígenos. El desarrollo de nuevos compuestos y la identificación de pistas para su posterior modificación requiere que se lleven a cabo ensayos de prueba del mecanismo. Hay muchos ensayos para evaluar el impacto en la proliferación; Sin embargo, la capacidad de quelar el hierro es una medida importante y a veces pasada por alto debido a los altos costos del equipo y al desafío de cuantificar rápida y reproduciblemente la fuerza de la quelación. Aquí, describimos un método fluorescente sin células cuantificable y económico para confirmar la capacidad de nuevos compuestos para quelar hierro. Nuestro ensayo se basa en el colorante fluorescente barato Calceína, disponible en el mercado, cuya fluorescencia se puede cuantificar en la mayoría de los lectores de placas fluorescentes de microtitulación. La calceína es un quelante débil del hierro, y su fluorescencia se apaga cuando se une al Fe2+/3+; la fluorescencia se restablece cuando un nuevo quelante supera a la calceína por el Fe2+/3+ unido. La eliminación del enfriamiento fluorescente y el aumento resultante de la fluorescencia permite determinar la capacidad de quelación de un nuevo quelante putativo. Por lo tanto, ofrecemos un ensayo económico y de alto rendimiento que permite la detección rápida de nuevos compuestos quelantes candidatos.

Introduction

Los cambios fenotípicos en las células que se relacionan con el desarrollo del cáncer a través de un conjunto común de capacidades biológicas alteradas ahora se conocen comúnmente como las características distintivas del cáncer. Entre ellos se encuentran los cambios resultantes de la reprogramación del metabolismo energético, que están muy extendidos en la biología de las célulascancerosas 1. Dicha reprogramación metabólica incluye un mayor requerimiento de hierro para apoyar la rápida proliferación y el crecimientotumoral 2. Esta sed de hierro conduce a un metabolismo del hierro desregulado, que en sí mismo se considera un sello distintivo del cáncer 3,4, con una desregulación que ocurre en todas las etapas5. Las características distintivas de la metástasis, propuestas más recientemente por Welch y Hurst, incluyen un papel para el hierro6, ya que el hierro puede inducir estrés oxidativo, y esto puede, a su vez, mediar cambios en el genoma, el epigenoma y el proteoma, aumentando la posibilidad de metástasis7. La relación entre los niveles de hierro y una mayor incidencia de cáncer ha sido demostrada a través de estudios epidemiológicos8.

Dado que las células cancerosas requieren grandes cantidades de hierro, son susceptibles a la deficiencia de hierro y, por lo tanto, a la quelación del hierro. Recientemente hemos publicado un artículo de revisión que destaca el potencial de la quelación del hierro para revertir varias características distintivas del cáncer a través de NDRG1 que interrumpe las vías de señalización oncogénica9. Sin embargo, el uso de la quelación del hierro como terapia oncológica independiente no ha arrojado resultados positivos en los ensayos clínicos debido a su toxicidad, su corta vida media, su rápido metabolismo y sus nuevos mecanismos de resistencia. Sin embargo, los quelantes de hierro se han mostrado prometedores en investigaciones in vitro e in vivo , lo que indica que se necesita más trabajo para desarrollar quelantes de hierro efectivos para la terapia del cáncer. La quelación específica del hierro es una estrategia validada en el descubrimiento de fármacos contra el cáncer, pero hasta la fecha solo se han descrito unas pocas clases10.

La identificación y caracterización de nuevos quelantes de hierro requiere la capacidad de medir su efecto en varios criterios de valoración. Muchos de ellos (como la proliferación, la apoptosis, la formación de especies reactivas de oxígeno) se miden de forma rutinaria y han sido esbozados y revisados en la literatura como métodos para evaluar las características distintivas del cáncer11. Al evaluar un nuevo quelante de hierro, muchos grupos examinan rutinariamente el efecto sobre las actividades antiproliferativas y redox, así como los efectos sobre la afluencia o el flujo de hierro. Las técnicas de predicción in silico 12 aumentan aún más la creciente reserva de quelantes de hierro que se pueden analizar.

La creación dequelantes de hierro requiere la capacidad de medir su efecto sobre los niveles de hierro como un medio para demostrar efectivamente la prueba de principio. Actualmente, el método más común para hacerlo es la citometría de flujo13 , que es costosa, requiere mucho tiempo y es poco cuantificable. La elección del ensayo a menudo se basa en la disponibilidad de equipo experimental, la velocidad y el costo de un ensayo. Por lo tanto, la capacidad de quelar el hierro puede ser una medida final que se pasa por alto debido a los altos costos de los equipos y al desafío de cuantificar rápida y reproduciblemente la fuerza de la quelación. Aquí, describimos un método fluorescente libre de células cuantificable y económico para confirmar la capacidad de nuevos compuestos para quelar hierro.

Protocol

1. Preparación de la solución madre Al preparar soluciones de calceína, evite la fotodegradación manteniendo las soluciones en la oscuridad. Prepare una solución de 1 mM de calceína en el PBS de Dulbecco, sin magnesio ni calcio14. Para 5 mL de solución de calceína 1 mM, agregue 3,1 mg de Calceína (622,5 g/M) a 5 mL de PBS de Dulbecco. Usando el calcetín de 1 mM de Calceína, prepare 1 mL de alícuotas de soluciones madre secund…

Representative Results

Para el método mostrado en el paso 2, este primer experimento (Figura 1) estableció el rango lineal del lector de placas de fluorescencia de microtitulación al detectar emisiones fluorescentes de calceína. Nuestros resultados representativos muestran un amplio rango lineal de fluorescencia de calceína de 0 a 100 μM. El análisis post hoc de ANOVA con LSD demuestra que hay diferencias estadísticamente significativas en la RFU media para todas las conce…

Discussion

La excesiva dependencia de los cánceres del hierro para alimentar su metabolismo hace que la quelación del hierro sea una adición potenciala los regímenes terapéuticos. Sin embargo, existe una capacidad limitada para detectar rápidamente nuevos quelantes de iones metálicos por su capacidad para unirse a iones de hierro. Se sabe que la sonda fluorescente Calceína, de uso común y ampliamente disponible, actúa como un quelante débil de hierro y la unión d…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a la Universidad de Northumbria por su apoyo.

Materials

Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma-Aldrich 215406 other wise known as FAS
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Deferiprone Sigma-Aldrich 379409
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D5652 magnesium and calcium free
Greiner CELLSTAR 96 well plates Sigma-Aldrich M0812 any optically transparent 96 well plate will work

Referencias

  1. Hsu, P. P., Sabatini, D. M. Cancer cell metabolism: Warburg and beyond. Cell. 134 (5), 703-707 (2008).
  2. Hsu, M. Y., Mina, E., Roetto, A., Porporato, P. E. Iron: An essential element of cancer metabolism. Cells. 9 (12), 2591 (2020).
  3. Torti, S. V., Torti, F. M. Iron and cancer: More ore to be mined. Nat Rev Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).
  4. Zhang, C., Zhang, F. Iron homeostasis and tumorigenesis: Molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Protein Cell. 6 (2), 88-100 (2015).
  5. Torti, S. V., Manz, D. H., Paul, B. T., Blanchette-Farra, N., Torti, F. M. Iron and cancer. Annu Rev Nutr. 38, 97-125 (2018).
  6. Welch, D. R., Hurst, D. R. Defining the hallmarks of metastasis. Cancer Res. 79 (12), 3011-3027 (2019).
  7. Lehmann, U., et al. Epigenetic defects of hepatocellular carcinoma are already found in non-neoplastic liver cells from patients with hereditary haemochromatosis. Hum Mol Genet. 16 (11), 1335-1342 (2007).
  8. Fonseca-Nunes, A., Jakszyn, P., Agudo, A. Iron and cancer risk–a systematic review and meta-analysis of the epidemiological evidence. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (1), 12-31 (2014).
  9. Abdelaal, G., Veuger, S. Reversing oncogenic transformation with iron chelation. Oncotarget. 12 (2), 106-124 (2021).
  10. Brown, R. A. M., et al. Altered iron metabolism and impact in cancer biology, metastasis, and immunology. Front Oncol. 10, 476 (2020).
  11. Menyhárt, O., et al. Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer. Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 300-319 (2016).
  12. Basu, A., et al. Discovering novel and diverse iron-chelators in silico. J Chem Inf Model. 56 (12), 2476-2485 (2016).
  13. Prus, E., Fibach, E. Flow cytometry measurement of the labile iron pool in human hematopoietic cells. Cytometry A. 73 (1), 22-27 (2008).
  14. Cold Spring Harb. . Phosphate-buffered saline (pbs). 2006 (1), (2006).
  15. Kontoghiorghes, G. J., Pattichis, K., Neocleous, K., Kolnagou, A. The design and development of deferiprone (l1) and other iron chelators for clinical use: Targeting methods and application prospects. Curr Med Chem. 11 (16), 2161-2183 (2004).

Play Video

Citar este artículo
Carter, A., Veuger, S., Racey, S. Quantifiable and Inexpensive Cell-Free Fluorescent Method to Confirm the Ability of Novel Compounds to Chelate Iron . J. Vis. Exp. (204), e66421, doi:10.3791/66421 (2024).

View Video