Summary

Investigación Aplicación de la onda de choque inducida por láser para el estudio de la lesión coclear inducida por explosión

Published: March 01, 2024
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Summary

Aquí, describimos los protocolos experimentales para crear un modelo animal de lesión coclear inducida por blastos utilizando ondas de choque inducidas por láser (LISW). La exposición del hueso temporal a LISW permite la reproducción de la fisiopatología coclear inducida por blastos. Este modelo animal podría ser una plataforma para dilucidar la patología coclear y explorar posibles tratamientos para las lesiones por blastos.

Abstract

El oído es el órgano más susceptible a la sobrepresión de la explosión, y las lesiones cocleares ocurren con frecuencia después de la exposición a la explosión. La exposición a explosiones puede provocar pérdida auditiva neurosensorial (SNHL), que es una pérdida auditiva irreversible que afecta negativamente a la calidad de vida. Se han documentado previamente patologías cocleares detalladas inducidas por blastos, como la pérdida de células ciliadas, neuronas ganglionares espirales, sinapsis cocleares y alteración de los estereocilios. Sin embargo, determinar el deterioro neurosensorial de la cóclea después de una lesión por explosión es un desafío porque los animales expuestos a la sobrepresión por explosión generalmente experimentan perforación de la membrana timpánica (TMP), que causa pérdida auditiva conductiva concurrente. Para evaluar la disfunción coclear neurosensorial pura, desarrollamos un modelo animal experimental de lesión coclear inducida por blastos utilizando una onda de choque inducida por láser. Este método evita la TMP y las lesiones sistémicas concomitantes y reproduce la disminución funcional del componente SNHL de una manera dependiente de la energía después de la exposición a LISW. Este modelo animal podría ser una plataforma para dilucidar los mecanismos patológicos y explorar posibles tratamientos para la disfunción coclear inducida por blastos.

Introduction

La pérdida de audición y el tinnitus se encuentran entre las discapacidades más prevalentes, reportadas en hasta el 62% de los veteranos. Se han notificado varias complicaciones auditivas inducidas por blastos, como la pérdida auditiva neurosensorial (SNHL) y la perforación de la membrana timpánica (TMP), en individuos expuestos a la sobrepresión blástica2. Además, la investigación en individuos expuestos a blastos sugiere que la exposición a blastos con frecuencia resulta en defectos en la resolución temporal auditiva, incluso cuando los umbrales de audición están dentro del rango normal, lo que se conoce como “pérdida auditiva oculta (HHL)”3. Está bien establecido que hay una pérdida sustancial de sinapsis cocleares entre las células ciliadas internas (IHC) y las neuronas auditivas (AN) en la patología coclear relacionada con blastos4. La degeneración sináptica da lugar a un deterioro del procesamiento auditivo y es un factor importante que contribuye al desarrollo de HHL5. Por lo tanto, los órganos auditivos son componentes frágiles que contienen estructuras complejas y altamente organizadas. Sin embargo, el mecanismo preciso por el cual las ondas expansivas afectan al oído interno a nivel celular sigue sin estar claro. Esto se debe a los desafíos para replicar las complejidades clínicas y mecánicas precisas de las lesiones por blastos en entornos de laboratorio y la complejidad de las patologías cocleares inducidas por blastos.

El componente principal de una lesión por explosión es la onda de choque (SW), caracterizada por un aumento rápido y alto de la presión máxima6. La complejidad de las lesiones por explosiones ha sido ampliamente investigada en numerosos estudios retrospectivos 7,8,9. Existen varios dispositivos para la generación de voladuras, como el gas comprimido10, los tubos de choque11 y los explosivos de pequeña magnitud12, a diferentes niveles de presión. La forma de onda de presión del SW generada por los dispositivos recientemente desarrollados se parecía mucho a la de una explosión real. Un concepto importante en el establecimiento de un modelo animal de pérdida auditiva neurosensorial inducida por blastos es minimizar las lesiones concomitantes, aparte del daño auditivo, para reducir la muerte de los animales. Por lo tanto, se han desarrollado estudios de lesiones por explosión en los que se han miniaturizado los tubos de choque y la salida se puede controlar con precisión para que los animales expuestos rara vez mueran. Sin embargo, aunque estos modelos animales suelen desarrollar complicaciones, como la TMP, la evaluación de la función coclear es difícil debido a la hipoacusia conductiva concurrente2. Anteriormente realizamos un estudio en animales con protección auditiva sobre lesiones por explosiones utilizando tapones para los oídos y no encontramos incidencia de TMP13. Los tapones para los oídos podrían atenuar parcialmente el daño coclear severo, pero no la neurodegeneración auditiva central o el desarrollo de tinnitus. Por lo tanto, los tapones para los oídos protegen la cóclea y la membrana timpánica. Sin embargo, se requiere un modelo animal de daño coclear puro inducido por blastos sin TMP para estudiar la fisiopatología coclear causada por lesiones por blastos.

Previamente desarrollamos un modelo de lesión por explosión tópica del oído interno en ratas y ratones utilizando una onda de choque inducida por láser (LISW)14,15. Este método puede realizarse de forma segura y sencilla a nivel de laboratorio estándar y se ha utilizado para generar modelos de lesiones pulmonares y craneales por blastos16,17. La energía del LISW se puede ajustar cambiando el tipo y la potencia del láser, lo que permite controlar el grado de daño coclear. El modelo de lesión coclear inducida por LISW es valioso para estudiar los mecanismos de la SNHL causada por lesiones por blastos e investigar posibles tratamientos. En este estudio, describimos protocolos experimentales detallados para crear un modelo de ratón de daño coclear inducido por blastos utilizando LISW y demostramos la degeneración coclear, incluida la pérdida de células ciliadas (HC), sinapsis cocleares y neuronas ganglionares espirales (SGN), de una manera dependiente de la energía en ratones después de la exposición a LISW.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Colegio Médico de Defensa Nacional (aprobación # 18050) y se realizaron de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud y el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón. Se hizo todo lo posible para minimizar el número de animales y su sufrimiento. 1. Animales Utili…

Representative Results

Forma de onda LISWLa reproducibilidad de la forma de onda de presión LISW se midió 5x a 2,0 J/cm2 de la siguiente manera. Las formas de onda fueron generalmente similares y estables y mostraron un fuerte aumento con el ancho de tiempo, la presión máxima y el impulso de 0,43±0,4 μs, 92,1 ± 6,8 MPa y 14,1 ± 1,9 Pa∙s (mediana ± SD), lo que corresponde a las características del SW (Figura 1B). Los LISW se caracterizan …

Discussion

Este estudio tuvo como objetivo validar un modelo de ratón de daño coclear inducido por blastos utilizando LISW. Nuestros hallazgos demostraron que después de la aplicación de LISW a través del hueso temporal, la oreja de los ratones expuestos exhibió una disminución patológica y fisiológica consistente en la cóclea, que se acompañó de un aumento en la sobrepresión de LISW. Estos resultados indican que este modelo de ratón es apropiado para replicar diversas patologías coc…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por dos subvenciones de JSPS KAKENHI (Números de subvención 21K09573 (K.M.) y 23K15901 (T.K.)).

Materials

532 nm Q-switched Nd:YAG laser  Quantel Brilliant b
ABR peak analysis software Mass Eye and Ear N/A EPL Cochlear Function Test Suite
Acrylic resin welding adhesive  Acrysunday Co., Ltd N/A
confocal fluorescence microscopy Leica TCS SP8
cryosectioning compound Sakura Tissue-Tek O.C.T
CtBP2 antibody BD Transduction #612044
Dielectric multilayer mirrors SIGMAKOKI CO.,LTD TFMHP-50C08-532 M1-M3
Digital oscilloscope Tektronix DPO4104B
Earphone CUI CDMG15008-03A
Hydrophone RP acoustics e.K. FOPH2000
Image J software plug-in NIH measurement line https://myfiles.meei.harvard.edu/xythoswfs/webui/_xy-e693768_1-t_wC4oKeBD
Light microscope Keyence Corporation BZ-X700
Myosin 7A antibody Proteus Biosciences #25–6790 
Neurofilament antibody Sigma #AB5539
Plano-convex lens SIGMAKOKI CO.,LTD SLSQ-30-200PM
Prism software GraphPad N/A ver.8.2.1
Scanning electron microscope JEOL Ltd JSM-6340F
Small digital endoscope AVS Co. Ltd AE-C1
Ultrasonic jelly Hitachi Aloka Medical N/A
Variable attenuator Showa Optronics Co. N/A Currenly avaiable successor: KYOCERA SOC Corporation, RWH-532HP II
Water-soluble encapsulant  Dako #S1964

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Kurioka, T., Mizutari, K., Niwa, K., Kimura, E., Kawauchi, S., Kobayashi, Y., Sato, S. Research Application of Laser-Induced Shock Wave for Studying Blast-Induced Cochlear Injury. J. Vis. Exp. (205), e66396, doi:10.3791/66396 (2024).

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