Perfusión quirúrgica y aislamiento del páncreas porcino para el aislamiento de islotes

Todos los procedimientos que involucran animales están aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la División de Medicina Comparativa de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington. Los cerdos Yorkshire adultos de entre 35 y 35 kg son ideales para este procedimiento; Sin embargo, el protocolo se puede adaptar para cerdos de diferentes tamaños dependiendo del contexto experimental. Todo el procedimiento debe realizarse de forma estéril en un quirófano. 1. Preparación preoperatoria y anestesia Sedar al cerdo con un cóctel de 4 mg/kg de tiletamina y zolazepam, 20 mg/kg de ketamina y 2 mg/kg de xilacina inyectados por vía intramuscular. Establecer el acceso venoso periférico a través de la vena auricular. Inducir anestesia general con isoflurano inhalado al 1%-3% en oxígeno al 100% e intubar endotraquealmente al cerdo.NOTA: Puede ser preferible usar propofol o cualquier otro agente de inducción intravenosa en lugar de inhalante para la inducción para un procedimiento de inducción e intubación más suave. Los signos vitales, el CO2 al final de la espiración, la saturación de oxígeno y la forma de onda cardíaca se monitorean continuamente para evaluar y mantener la profundidad de la anestesia. El plano quirúrgico abdominal se confirma mediante ecografía a pie de cama. Afeitar y preparar al cerdo con gluconato de clorhexidina desde la escotadura esternal hasta las ingles bilaterales. Cubra el campo operatorio con una vista clara de todo el abdomen (Figura 1A). 2. Montaje operatorio y exposición del retroperitoneo Realizar una incisión de laparotomía en la línea media (Figura 1B).Use un bisturí de 10 hojas y electrocauterio para hacer una laparotomía de línea media desde la apófisis xifoides hasta el pubis. Tenga cuidado de curvar la incisión alrededor de la abertura urogenital abdominal inferior. Realiza una rotación visceral a la derecha.Exteriorizar el colon derecho y el intestino delgado, envolviéndolos en una toalla estéril. Retraiga suavemente el colon y el intestino hacia la izquierda para exponer el retroperitoneo derecho y evitar la torsión o malrotación intestinal. Drene la vejiga (opcional).Si la vejiga está llena y afecta la exposición, sujete la vejiga entre dos pinzas DeBakey y use un bisturí de 11 hojas para incidir la pared de la vejiga ventral. Coloque una punta de succión Yankauer en la vejiga para drenar la orina y descomprimir la vejiga. Establecer un conjunto de retractores abdominales para facilitar la exposición óptima del retroperitoneo derecho (Figura 1C). 3. Disección retroperitoneal Iniciar la disección retroperitoneal (Figura 2A).Mediante electrocauterización, incida el peritoneo a la derecha de la línea media, desde el nivel del riñón derecho hasta la bifurcación aórtica. Exponga bruscamente la aorta infrarrenal, la vena cava inferior (VCI) y la arteria y vena renal derecha Obtener el control circunferencial de la aorta infrarrenal distal con un asa vascular grande. Ligar la VCI (Figura 2B).Obtener el control circunferencial de la VCI infrarrenal media. Ligue el IVC con una corbata de seda 2-0. Ligar los vasos renales (Figura 2C).Obtener el control circunferencial de las arterias y venas renales derecha e izquierda. Libra estas estructuras con lazos de seda 2-0. Si hay varias arterias renales, aísle y lige de manera similar cada uno de estos vasos. 4. Disección intratorácica Incisión en el hemidiafragma derecho (Figura 3A).Retraiga suavemente el hígado inferiormente para exponer el hemidiafragma derecho. Aplique dos pinzas Allis en la porción membranosa del hemidiafragma derecho y haga una incisión en el diafragma entre las dos pinzas mediante electrocauterización. Extienda la miotomía del diafragma a aproximadamente 7 cm horizontalmente. Obtener el control circunferencial de la VCI intratorácica (Figura 3B).Coloque una brida de seda 2-0 alrededor de la VCI intratorácica. Encaje los extremos de la sutura con un pequeño hemostático sin ocluir la VCI. Extienda el diafragmomía hasta el hemidiafragma izquierdo (Figura 3C).Utilice dos pinzas Allis para retraer el borde del diafragmotomía inferiormente y extenderlo hasta el hemidiafragma izquierdo.NOTA: Evite entrar en el pericardio durante la diafragmotomía. Exponga la aorta torácica descendente en la región posteromedial izquierda del tórax. 5. Canulación aórtica infrarrenal, aislamiento visceral y perfusión Anticoagular sistémicamente al cerdo.Administrar heparina sistémica (100 U/kg) por vía venosa periférica. Espere 3 minutos antes de proceder con la canulación aórtica. Acceso a la aorta infrarrenal mediante aguja de micropunción de 18 G (Figura 4A). Pase un alambre en J a través de la aguja hasta la aorta y retire la aguja sobre el alambre. Coloque una vaina de 10 Fr sobre el alambre en la aorta y retire el alambre (Figura 4B). Conecte el tubo intravenoso a la vaina de 10 Fr y, de forma estéril, infunda la solución de UW a través de la funda. Infundir la solución de UW a una velocidad de 40-60 gotas/min.NOTA: El flujo no comenzará hasta que la aorta torácica esté sujetada de forma cruzada. Asegúrese de que el tubo intravenoso no esté en tensión para evitar el desplazamiento de la vaina intraaórtica. Realizar aislamiento visceral y perfusión en rápida sucesión.Pinzar la aorta infrarrenal con una pinza aórtica. Pinza la aorta torácica descendente con una pinza aórtica. Empate la VCI intratorácica con el empate 2-0 colocado anteriormente. Administrar 100 mg/kg de KCl para eutanasia a través de acceso venoso periférico.NOTA: La muerte cardíaca comienza con la administración de KCl. Realizar una venotomía en la VCI infrarrenal, superior al lazo 2-0, e insertar la aspiración en la punta de la piscina a través de la venotomía (Figura 4C). Perfundir las vísceras con 2-3 L de solución fría de UW. Proceda con la disección para la pancreatectomía total durante la perfusión.NOTA: Las vísceras, y el páncreas en particular, deben volverse pálidos a medida que la solución de UW se perfunde en la región del órgano sólido (Figura 5A). 6. Pancreatectomía total Libere el intestino delgado de la retracción ya que la solución de UW es perfusiva. Comienza la disección de los lóbulos duodenales, conectivos y esplénicos del páncreas durante la perfusión visceral. Retraiga el estómago superiormente para exponer el páncreas. Con una combinación de disección roma y electrocauterización, diseccione el páncreas de sus inserciones omentales.NOTA: El cuerpo del páncreas envuelve eficazmente la vena porta. Tenga cuidado de evitar que la vena porta vaya posteriormente al lóbulo duodenal y luego anteriormente al puente y a los lóbulos de conexión. Aislar el conducto pancreático (Figura 5B). Localiza el conducto pancreático donde entra al duodeno. Lime el conducto con dos bridas de seda 3-0 y seccione el conducto entre las ataduras. Pancreatectomía completa (Figura 5C).Diseccionar el resto del lóbulo duodenal desde el asa C del duodeno hasta que se mueva libremente. Separe el páncreas de sus uniones restantes. Ligar y dividir cuidadosamente los vasos pequeños desde la arteria mesentérica superior hasta el páncreas. Separa el páncreas de la vena porta. Diseccionar el cuerpo del páncreas y el lóbulo de conexión de la vena porta. Ligue cualquier rama venosa desde la vena porta hasta el páncreas, incluida la vena esplénica.Transsectar el puente del páncreas entre el lóbulo de conexión y el lóbulo esplénico para permitir la libre movilización de la vena porta.NOTA: Tenga cuidado de no separar el lóbulo duodenal pancreático del lóbulo esplénico. Sumerja todo el páncreas en una solución estéril fría de UW, colocando el recipiente inmediatamente sobre hielo. Transporte el páncreas a una funda estéril para el aislamiento de los islotes. Proceder con el aislamiento de los islotes pancreáticos (Figura 6). 7. Canulación del conducto pancreático Coloque el páncreas en una bandeja estéril con hielo dentro de la cabina de bioseguridad. Diseccionar el exceso de tejido fibroso y sangre del páncreas. Si es necesario, corte el conducto transversalmente para visualizar mejor el lumen. Localice y avance la cánula en el conducto con un catéter de tamaño adecuado (16 G). Asegure el catéter en su lugar con una brida de seda 2.0, pero evite ocluir el lumen. Prepare tres soluciones de descontaminación y sumerja el páncreas canulado en cada solución de descontaminación durante 60 s. 8. Perfusión y distensión del páncreas Prepare la solución de digestión enzimática (Figura 6).Mezcle 100 mg de soluciones de colagenasa 1 y 2 disponibles comercialmente (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) con la cantidad deseada de 1x HBSS y 10,000 U de solución de heparina. Si el tejido pancreático aislado está entre 100 g y 200 g, mezcle la enzima con un total de 200 ml de solución de HBSS y heparina. Infundir el páncreas con la solución enzimática.Con una fuerza moderada controlada, infunda la solución enzimática en bolos de 60 ml en el conducto pancreático. Continúe este proceso hasta que la totalidad de la solución enzimática se infunda en el páncreas.NOTA: Una infusión eficaz debe hacer que el tejido del páncreas se distienda. Si alguna solución enzimática se filtra del tejido del páncreas a la bandeja estéril, vuelva a inyectar esta solución restante en el páncreas en el paso 8.3 o colóquela en la cámara Ricordi en el paso 9.2. Inyecte directamente cualquier solución enzimática restante en cualquier segmento de parénquima pancreático muy distendido con una aguja de 22 G. 9. Digestión del páncreas Coloque el depósito del circuito que contiene 500 mL de 1x HBSS en un baño de agua ajustado a 47 °C para precalentar la solución del depósito.NOTA: La solución enzimática funciona de manera óptima a 36-38 °C y esta temperatura debe alcanzarse dentro de los 5 minutos posteriores al arranque de la bomba peristáltica. La temperatura del contenido del Ricordi, incluido el páncreas infundido con enzimas, es inicialmente de 4 °C. Al precalentar el depósito del circuito a 47 °C, el contenido del depósito y de la cámara Ricordi se mezclará, lo que elevará la temperatura de todo el circuito a 36-38 °C a los 5 minutos de poner en marcha la bomba peristáltica. Retire y deseche el catéter del conducto pancreático y corte el páncreas en trozos de ~1-3 cm. Prepara el circuito de digestión. La bomba peristáltica hará circular la solución desde el depósito del circuito de digestión, a través del serpentín de calentamiento, y hacia la cámara Ricordi (Figura 6). Coloque las piezas de páncreas con nueve canicas de nitruro de silicio de 1,5 cm dentro de la cámara Ricordi y llene hasta el nivel del filtro con la solución enzimática restante. Para sellar la cámara Ricordi, coloque el filtro de malla y la junta de goma, seguidos de la tapa en la cámara Ricordi. Asegure la tapa de la cámara Ricordi apretando los tornillos y asegúrese de que la cámara esté bien sellada antes de continuar. Coloque el serpentín de calentamiento en un baño de agua caliente a 47 °C. Coloque las cánulas de entrada y salida en el depósito del circuito de digestión que contiene 500 mL de 1x HBSS. Ponga en marcha la bomba a un caudal de 450 mL/min hasta que toda la cámara esté llena con la solución de digestión. Disminuya el caudal a 100 mL/min a medida que el fluido circula dentro del circuito. Agitar manualmente la cámara de digestión para agitar el tejido con las canicas de nitruro de silicio. Comenzando con 8 minutos de digestión, tome una muestra de 1 mL del depósito del circuito para la tinción con ditizona (DTZ) para monitorear el progreso de la digestión.Para preparar la tinción con DTZ, disuelva 10 mg de DTZ en 2 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Añadir 10 μL de la tinción DTZ preparada a 1 mL de la muestra de digestión. Inspeccione la muestra con un aumento de 4x. Los islotes aparecerán de color rojo oscuro a negro con tinción DTZ.NOTA: La digestión es completa cuando la mayoría o todos los islotes observados están “libres” e intactos, con el tejido acinar disperso en grupos más pequeños. Cuando la digestión se considere completa, transfiera el serpentín al baño de hielo, retire la cánula de entrada del depósito y aumente la velocidad de la bomba a 210-250 mL/min. Deje que el tejido digerido drene de la cámara Ricordi al depósito del circuito.NOTA: Es típico ver muy poco tejido restante en la cámara de Ricordi después de la digestión. Por lo general, <10% del tejido pancreático no digerido permanecerá, aunque esto puede variar debido a factores específicos de la muestra. Pesar el tejido restante para determinar la eficiencia de la digestión. Transfiera el tejido digerido del depósito del circuito a tubos cónicos de 250 mL que se mantienen fríos en hielo. 10. Recolección de tejido pancreático Centrifugar el tejido pancreático digerido en tubos cónicos de 250 mL a 250 × g durante 1 min a 4 °C sin freno. Retire los tubos de la centrífuga con precaución y aspire el sobrenadante con una pipeta serológica evitando la interrupción del pellet. Vuelva a suspender los gránulos en cada tubo cónico suavemente y combínelos en un tubo cónico de 250 ml. Si hay ≤50 mL de tejido, vuelva a suspender el pellet hasta un volumen total de 100 mL en la solución de recolección de islotes. Si hay >50 mL de tejido, vuelva a suspender el pellet a un volumen total de 200 mL en la solución de recolección de islotes. En el caso de que se recolecten más de 100 ml de tejido, ejecute dos ciclos de purificación del procesador celular. Vuelva a suspender el tejido en medio RPMI para obtener un volumen total de 100 mL (suponiendo que se recolectaron 50 mL de tejido) y cargue en el procesador celular. 11. Depuración de islotes mediante el método de gradiente continuo Prepare el procesador de celdas según las instrucciones del fabricante. Cargue 125 mL de solución de gradiente de alta densidad en el formador de gradiente continuo, luego cargue la solución de gradiente de alta densidad en el procesador de celdas usando una bomba configurada a 200 mL/min. Inicie la función de centrífuga del procesador de celdas a 1.000 RPM. Libere el aire del sistema y vuelva a cebarlo con la solución de gradiente de alta densidad. Agregue 125 mL de solución de gradiente de alta densidad y 130 mL de solución de baja densidad al formador de gradiente. Cargue los 100 mL de suspensión de tejido digerido. Aumente la velocidad del procesador de celdas a 2.000 RPM durante 3 minutos. Preparar 16 tubos cónicos de 50 mL para la recolección de fracciones de islotes purificadas. Agregue 25 mL de medio RPMI a cada tubo y coloque todos los tubos en orden ascendente. Recoja las fracciones de islotes purificadas en los tubos cónicos de recolección preparados. 12. Evaluación y tinción de islotes Recoja 100-200 μL de alícuotas de cada una de las fracciones de islotes purificadas y colóquelas en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos para la tinción con DTZ para evaluar el contenido de islotes y de cada fracción de purificación. Inspeccione cada fracción con microscopía óptica con aumento de 4x. Los islotes aparecerán de color rojo oscuro a negro con tinción DTZ. Una vez identificados los islotes, seleccione las fracciones con mayor contenido de islotes. Centrifugar la fracción purificada a 250 × g durante 1 min a 4 °C sin freno. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender la pelleta del islote en el medio de crecimiento del islote. Transfiera los islotes purificados a 1-4 matraces de cultivo T-125. Después de la purificación, evalúe la cantidad, viabilidad y función de los islotes.Utilice un contador de celdas de islotes para evaluar el número de islotes y la distribución del tamaño (Figura 7A). Un páncreas entero suele producir entre 1 y 2 millones de islotes equivalentes. Para la tinción de viabilidad, mezcle 2 μL de calceína AM y 2 μL de homodímero de etidio-1 (CaAM/EthD-1) con 1.000 μL de PBS (Figura 7B). Deje que los islotes se tiñan durante 30 minutos, luego evalúelos con un aumento de menos de 4x o 10x. Los islotes viables se teñirán de verde, mientras que los islotes no viables se teñirán de rojo. 13. Cultivo celular de islotes pancreáticos Durante las 48 h iniciales, cultive los islotes en medio de recuperación a 37 °C para proporcionar suficientes nutrientes (~1.000 islotes/mL de medio de recuperación). De los días 2 a 21, cultivar los islotes en un medio de crecimiento estándar a 37 °C.