Las inyecciones intrafemorales permiten el injerto de un pequeño número de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC), colocando las células directamente en la cavidad de la médula ósea. En este trabajo describimos un protocolo experimental de inyección intrafemoral de HSPCs humanas en ratones inmunodeficientes.
Las células madre hematopoyéticas (HSC, por sus siglas en inglés) se definen por su capacidad de producir todos los tipos de células sanguíneas a lo largo de su vida. Esto se prueba operativamente mediante el trasplante de poblaciones celulares que contienen HSC en ratones singénicos o inmunocomprometidos. A continuación, se mide el tamaño y la composición multilinaje del injerto a lo largo del tiempo, normalmente mediante citometría de flujo. Clásicamente, una población que contiene HSC se inyecta en la circulación del animal, después de lo cual las HSC se dirigen a la médula ósea, donde se alojan y comienzan a producir sangre. Alternativamente, las HSC y/o las células progenitoras (HSPC) pueden colocarse directamente en la cavidad de la médula ósea.
En este artículo se describe un protocolo para la inyección intrafemoral de HSPCs humanas en ratones inmunodeficientes. En resumen, se anestesia a los ratones preacondicionados y se perfora un pequeño orificio a través de la rodilla hasta el fémur con una aguja. Usando una aguja de insulina más pequeña, las células se inyectan directamente en el mismo conducto creado por la primera aguja. Este método de trasplante se puede aplicar en diversos diseños experimentales, utilizando células de ratón o humanas como células donantes. Ha sido el más utilizado para el xenotrasplante, porque en este contexto, se cree que proporciona un mejor injerto sobre las inyecciones intravenosas, mejorando así el poder estadístico y reduciendo el número de ratones a utilizar.
La sangre tiene una de las tasas de regeneración más altas del cuerpo humano, produciendo 1 × 1012 células por día enla médula ósea humana adulta. Las células madre hematopoyéticas (HSC) garantizan la producción de sangre a lo largo de la vida mediante el proceso de hematopoyesis y se definen por su capacidad para producir todos los tipos de células sanguíneas (multipotencialidad) mientras se mantienen (autorrenovación). Históricamente, el estándar de oro para probar la función de un HSC siempre se ha basado en el trasplante, probando la capacidad de una población de donantes para reconstituir todos los linajes sanguíneos de un ratón a largo plazo (comúnmente definido como un mínimo de 20 semanas)2. Un gran número de trabajos funcionales que abarcan varias décadas han demostrado que el compartimento HSC es heterogéneo tanto en la producción de linaje como en la reconstitución a largo plazo. El conjunto de herramientas para estudiar la hematopoyesis se ha ampliado considerablemente a lo largo de los años, con muchas técnicas nuevas, incluidos los ensayos funcionales in vitro de una sola célula, los enfoques ómicos de una sola célula y el rastreo de linaje3. Estos últimos han demostrado de manera concluyente que las contribuciones de las HSC y los progenitores multipotentes difieren en gran medida en la hematopoyesis nativa y bajo el estrés impuesto por el trasplante. Todas estas técnicas complementan los ensayos de trasplante, que siguen siendo importantes para evaluar la capacidad de repoblación a largo plazo de las HSC. En el contexto del estudio de la hematopoyesis humana, el xenotrasplante proporciona el único método para evaluar experimentalmente la autorrenovación en un entorno de organismo completo.
El xenotrasplante de HSC se realiza comúnmente mediante la inyección intravenosa de células en ratones inmunocomprometidos. Sin embargo, las HSC son raras4 y el acceso a las muestras humanas que las contienen es limitado. En 2003, el grupo de John Dick adaptó un protocolo para la aspiración de médula ósea y la inyección intrafemoral de ratones diabéticos/inmunodeficiencia combinada grave (NOD-SCID) con células de sangre de cordón umbilical (CB) Lin-CD34+ 5. Hasta donde sabemos, no se ha informado de una comparación formal de las inyecciones intravenosas frente a las intrafemorales en los resultados de trasplante a largo plazo y en serie. Sin embargo, en comparación directa con las inyecciones intravenosas, las inyecciones intrafemorales proporcionan injertos de mayor tamaño con el mismo número de células trasplantadas6, al menos a corto plazo. Además, el injerto se puede detectar con muchas menos células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) trasplantadas. Se cree que esto se debe a que la administración intrafemoral evita la necesidad de que las HSC lleguen a la médula ósea, lo que en el contexto del xenoinjerto es limitante debido a la falta de reactividad entre especies para una serie de receptores y citocinas. Mediante el uso de inyecciones intrafemorales, Notta y sus colegas fueron los primeros en trasplantar HSC humanasindividuales 7, aunque se deben tener consideraciones adicionales, como se describe en sus métodos. La administración intrafemoral de HSPC también tiene limitaciones. La inyección en sí misma altera y destruye parte de la médula ósea y, por lo tanto, no está indicada para estudios de la diafonía entre las HSC y su microambiente de médula ósea. Además, el número máximo de células está limitado por el volumen de esa cavidad ósea y eso puede ser demasiado pequeño para algunas aplicaciones. Al igual que con todas las técnicas, su aplicación en un experimento específico debe sopesarse en función de los beneficios/desventajas y de la pregunta que se hace. En el contexto de los xenotrasplantes, si el objetivo del experimento es probar el injerto de un número bajo de HSPCs humanas sin evaluar el microambiente, la administración intrafemoral suele ser preferible a la inyección intravenosa.
Las inyecciones intrafemorales son una herramienta útil en el xenotrasplante cuando solo se dispone de un pequeño número de HSPC, lo que proporciona un mejor injerto en comparación con las inyecciones intravenosas. Sin embargo, la técnica requiere destreza y entrenamiento. Al practicar, recomendaríamos usar cadáveres frescos del rango de peso correcto (ver más abajo) e inyectar un tinte de color (como el azul tripán) para que en la disección, quede claro si la inyección entró…
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen al grupo del Dr. John Dick por su trabajo previo en este método, y a Monica Doedens por su formación. Agradecemos al Biobanco de Sangre y Células Madre de Cambridge (CBSB), específicamente a la Dra. Joanna Baxter y al equipo de enfermeras del CBSB que dieron su consentimiento y recolectaron muestras de sangre del cordón umbilical; nuestros donantes de muestra; al Servicio Biomédico de la Universidad, específicamente a Nicolas Lumley y al personal del Edificio Anne McLaren para el mantenimiento de nuestras cepas de ratones y el apoyo a nuestros experimentos in vivo ; Shaaezmeen Basheer por la edición del manuscrito.
E.L. está financiada por una beca Sir Henry Dale financiada conjuntamente por el Wellcome Trust y la Royal Society (107630/Z/15/A). L.M. cuenta con el apoyo de Sofinter – Programa de Bienestar de RRHH. Esta investigación fue financiada en su totalidad o en parte por el Wellcome Trust (203151/Z/16/Z, 203151/A/16/Z, 215116/Z/18/Z) y el Consejo de Investigación Médica del UKRI (MC_PC_17230). A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia pública de derechos de autor CC BY a cualquier versión del Manuscrito Aceptado por el Autor que surja de esta presentación.
0.5 mL Insulin Syringe with 29 G x 12.7 mm Needle | BD | 324892 | |
1 mL Insulin Syringe with 29 G x 0.5" Needle | BD | 324827 | |
1.5 mL tube | Fisherbrand | 509-GRD-PFB | |
3 mL syringe | HENKE SASS WOLF GMBH | 4020.000V0 | |
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm | Falcon | 352235 | FACS tube |
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Snap Cap 12 x 75 mm | Falcon | 352058 | FACS tube |
27 G 1/2" needle | BD | 300635 | |
40 µm cell strainer for 50 mL tube | Greiner Bio-one | 542040 | |
50 mL tube | Sarstedt Ltd | 62.547.254 | |
96 well round-bottom plate | Falcon | 351177 | |
Alcohol Swab | VITREX MEDICAL A/S | 520213 | |
BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer | BD | flow cytometer | |
Buphrenorphine | Animalcare | XVD190 | |
CD14/PECy7 (Clone M5E2) | biolegend | 301814 | Used at 1 in 1000 |
CD19/Alexa 700 (Clone HIB19) | biolegend | 302226 | Used at 1 in 300 |
CD19/FITC (Clone HIB19) | biolegend | 302206 | Used at 1 in 200 |
CD3/APCCy7 (Clone HIT3a) | biolegend | 300318 | Used at 1 in 100 |
CD33/APC (Clone P67.6) | BD | 345800 | Used at 1 in 200 |
CD45/BV510 (Clone HI30) | biolegend | 304036 | Used at 1 in 500 |
CD45/PECy5 (Clone 2D1) | biolegend | 368526 | Used at 1 in 300 |
CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | |
Dnase 1 | Worthington Biochemical | LS002139 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | PAN-Biotech | P40-37500 | |
Glycophorin A (GlyA)/PE (Clone GA-R2) | BD | 340947 | Used at 1 in 1000 |
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | PAN-Biotech | P04-20250 | |
Isoflurane (IsoFlo 100% w/w Inhalation Vapor, liquid) | Zoetis | 115095 | |
Microvette 300 Lithium heparin LH, 300 µL | Sarstedt Ltd | 20.1309 | Mouse blood collection tube |
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | Charles River | ||
Pancoll human, Density: 1.077 g/mL | PAN-Biotech | P04-60500 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190169 |