Kationische Nanoemulsions-verkapselte Retinsäure als Adjuvans zur Förderung von OVA-spezifischen systemischen und mukosalen Reaktionen
Summary
In diesem Protokoll haben wir eine mit einer kationischen Nanoemulsion verkapselte Retinsäure (RA) entwickelt, die als Adjuvans verwendet werden kann, um antigenspezifische systemische und mukosale Reaktionen zu fördern. Durch die Zugabe der von der FDA zugelassenen RA zur Nanoemulsion wurde antigenspezifisches sIgA in der Vagina und im Dünndarm nach intramuskulärer Injektion der Nanoemulsion gefördert.
Abstract
Kationische Nanostrukturen haben sich als adjuvans- und Antigenabgabesystem herausgestellt, das die Reifung dendritischer Zellen, die ROS-Erzeugung und die Antigenaufnahme verbessert und dann antigenspezifische Immunantworten fördert. In den letzten Jahren hat Retinsäure (RA) aufgrund ihrer Wirkung bei der Aktivierung der Immunantwort der Schleimhaut zunehmend Aufmerksamkeit erhalten. Um RA jedoch als Schleimhautadjuvans zu verwenden, ist es notwendig, das Problem seiner Auflösung, Belastung und Abgabe zu lösen. Hier beschreiben wir ein kationisches Nanoemulsions-verkapseltes Retinsäure-Verabreichungssystem (CNE-RA), das aus dem kationischen Lipid 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOTAP), Retinsäure, Squalen als Ölphase, Polysorbat 80 als Tensid und Sorbitantrioleat 85 als Co-Tensid besteht. Seine physikalischen und chemischen Eigenschaften wurden mit Hilfe von dynamischer Lichtstreuung und einem Spektralphotometer charakterisiert. Die Immunisierung von Mäusen mit der Mischung aus Antigen (Ovalbumin, OVA) und CNE-RA erhöhte signifikant die Spiegel von anti-OVA-sekretorischem Immunglobulin A (sIgA) in der vaginalen Spülflüssigkeit und der Dünndarmspülung von Mäusen im Vergleich zu OVA allein. Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur Vorbereitung, Charakterisierung und Bewertung der adjuvanten Wirkung von CNE-RA.
Introduction
Adjuvantien werden häufig eingesetzt, um die Wirksamkeit eines Impfstoffs zu erhöhen, indem sie das Immunsystem dazu anregen, stärker auf den Impfstoff zu reagieren, wodurch die Immunität gegen einen bestimmten Erreger erhöhtwird 1. Nanoemulsion (NE)-Adjuvans bezieht sich auf ein kolloidales Dispersionssystem mit thermodynamischer Stabilität, indem es einen bestimmten Anteil der Ölphase und der wässrigen Phase emulgiert, um eine Emulsion in Form von Wasser-in-Öl (W/O) oder Öl-in-Wasser (O/W)2 zu erzeugen. O/W-Nanoemulsions-Adjuvans können Zytokine und Chemokine an der Injektionsstelle produzieren, die schnelle Aggregation und Proliferation wichtiger Immunzellen wie Monozyten, Neutrophile und Eosinophile induzieren, die Immunantwort verstärken und die Immunogenität von Antigenen verbessern3. Derzeit sind drei Nanoemulsions-Adjuvantien (MF59, AS03 und AF03) für die Verwendung in Impfstoffen zugelassen und haben eine gute Sicherheit und Wirksamkeit gezeigt4.
Die Immunität der Schleimhäute wurde jedoch durch die derzeit zugelassenen adjuvanten Formulierungen bei der konventionellen parenteralen Impfung nur unzureichend berücksichtigt5. Es wurde berichtet, dass Retinsäure (RA) das intestinale Homing von Immunzellen induziert, aber ihre niedrige Polarität, ihre schlechte Löslichkeit in Wasser und ihre schlechte Licht- und Wärmestabilität schränken ihre Verwendung für eine robuste enterische Impfung ein. Nanoemulsionen bieten die Möglichkeit, die Bioverfügbarkeit von hochlipophilen Arzneimitteln zu erhöhen, und der Ölkern von O/W-Emulsionsadjuvantien eignet sich zum Auflösen von unpolaren Substanzen wie RA6. Daher können Nanoemulsionen als Träger für RA verwendet werden, um den dualen Response-Effekt von systemischer Immunität und Schleimhautimmunität zu erzielen.
Im Vergleich zu neutralen oder anionischen Verabreichungssystemen weisen kationische Verabreichungssysteme relativ effiziente Antigenverkapselungs- und -abgabefähigkeiten auf, die die Immunogenität von Antigenen verbessern können 7,8,9. Die kationische Oberflächenladung einer Vielzahl von adjuvanten Systemen ist wichtig für ihre adjuvante Wirkung 10,11,12. Die kationische Ladung ist ein wichtiger Faktor bei der Verlängerung der Retention des Impfstoffs an der Injektionsstelle, der Erhöhung der Antigenpräsentation und der Verlängerung der Stimulation der zellulären Immunität im Körper12.
Basierend auf den oben genannten Überlegungen haben wir eine kationische Nanoemulsion entwickelt, um RA und Antigene effektiv gemeinsam zu liefern. Die Partikelgröße und das Zetapotenzial der Nanoemulsion wurden mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) bestimmt, und die systemischen und mukosalen Immunantworten der Nanoemulsion in Kombination mit OVA wurden durch intramuskuläre Injektion bewertet13.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll haben wir eine kationische, in Nanoemulsion verkapselte Retinsäure entwickelt, die als Adjuvans verwendet werden kann, um antigenspezifische systemische und mukosale Reaktionen zu fördern. Im Vergleich zu herkömmlichen NE-Adjuvantien hat es die folgenden zwei Vorteile. Erstens weist die Oberfläche von O/W NEs im Allgemeinen eine hohe negative Ladung auf, was es schwierig macht, Antigene direkt zu laden. Kationische NEs können Peptid- oder Proteinantigene effektiv adsorbieren und die spezifische I…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde vom Key Program der Chongqing Natural Science Foundation (Nr. cstc2020jcyj-zdxmX0027) und dem Chinese National Natural Science Foundation Project (Nr. 32270988) finanziert.
Materials
| 1640 medium | GIBCO, USA | C11875500BT | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab171529-1000 mL | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| DOTAP | CordenPharma, Switzerland | O02002 | |
| ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP) | mabtech | ab205719 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1(HRP) | Abcam | ab97240-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP) | Abcam | ab97235-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | Ab205720-500ug | |
| Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP) | Abcam | ab97245-1mg | |
| High pressure homogenizer | ATS | ||
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| OVA323-339 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| retinoic acid | TCI, Japan | TCI-R0064-5G | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| T10 basic Ultra-Turrax | IKA, Germany | ||
| TMB ELISA Substrate | Abcam | ab171523-1000ml | |
| trypsin inhibitor | Diamond | A003570-0100 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 |
Referencias
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