Acide rétinoïque encapsulé dans une nanoémulsion cationique en tant qu’adjuvant pour favoriser les réponses systémiques et muqueuses spécifiques de l’OVA
Summary
Dans ce protocole, nous avons développé un acide rétinoïque (AR) encapsulé dans une nanoémulsion cationique à utiliser comme adjuvant pour favoriser les réponses systémiques et muqueuses spécifiques de l’antigène. En ajoutant l’AR approuvé par la FDA à la nanoémulsion, la sIgA spécifique de l’antigène a été promue dans le vagin et l’intestin grêle après l’injection intramusculaire de la nanoémulsion.
Abstract
Les nanostructures cationiques sont apparues comme un adjuvant et un système d’administration d’antigène qui améliore la maturation des cellules dendritiques, la génération de ROS et l’absorption de l’antigène, puis favorise les réponses immunitaires spécifiques à l’antigène. Ces dernières années, l’acide rétinoïque (AR) a fait l’objet d’une attention croissante en raison de son effet sur l’activation de la réponse immunitaire des muqueuses ; cependant, afin d’utiliser la PR comme adjuvant de la muqueuse, il est nécessaire de résoudre le problème de sa dissolution, de sa charge et de son administration. Ici, nous décrivons un système d’administration d’acide rétinoïque encapsulé dans une nanoémulsion cationique (CNE-RA) composé du lipide cationique 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOTAP), de l’acide rétinoïque, du squalène en tant que phase huileuse, du polysorbate 80 en tant que tensioactif et du trioléate de sorbitan 85 en tant que co-surfactant. Ses propriétés physiques et chimiques ont été caractérisées à l’aide d’une diffusion dynamique de la lumière et d’un spectrophotomètre. L’immunisation des souris avec le mélange d’antigène (ovalbumine, OVA) et d’ANC-RA a significativement augmenté les taux d’immunoglobuline sécrétoire A (sIgA) anti-OVA dans le liquide de lavage vaginal et le liquide de lavage de l’intestin grêle des souris par rapport à l’OVA seul. Ce protocole décrit une méthode détaillée pour la préparation, la caractérisation et l’évaluation de l’effet adjuvant de l’AR-CNE.
Introduction
Les adjuvants sont souvent utilisés pour améliorer l’efficacité d’un vaccin en stimulant le système immunitaire à réagir plus fortement au vaccin, augmentant ainsi l’immunité contre un agent pathogène particulier1. L’adjuvant de nanoémulsion (NE) fait référence à un système de dispersion colloïdale avec une stabilité thermodynamique en émulsionnant une certaine proportion de phase huileuse et de phase aqueuse pour produire une émulsion sous forme d’eau dans l’huile (P/O) ou d’huile dans l’eau (H/O)2. L’adjuvant de nanoémulsion H/E peut produire des cytokines et des chimiokines au site d’injection, induire l’agrégation et la prolifération rapides de cellules immunitaires importantes telles que les monocytes, les neutrophiles et les éosinophiles, et renforcer la réponse immunitaire et améliorer l’immunogénicité des antigènes3. À l’heure actuelle, trois adjuvants de nanoémulsion (MF59, AS03 et AF03) ont été homologués pour une utilisation dans les vaccins et ont montré une bonne innocuité et efficacité4.
Cependant, l’immunité des muqueuses a été mal prise en compte par les formulations adjuvantes actuellement autorisées dans la vaccination parentérale conventionnelle5. Il a été rapporté que l’acide rétinoïque (AR) induit le retour intestinal des cellules immunitaires, mais sa faible polarité, sa faible solubilité dans l’eau et sa faible stabilité à la lumière et à la chaleur limitent son utilisation pour la vaccination entérique robuste. Les nanoémulsions offrent des possibilités d’augmenter la biodisponibilité des médicaments hautement lipophiles, et le noyau huileux des adjuvants d’émulsion H/E convient à la dissolution de substances non polaires telles que le RA6. Par conséquent, les nanoémulsions peuvent être utilisées comme vecteurs de la PR afin d’obtenir l’effet de double réponse de l’immunité systémique et de l’immunité muqueuse.
Comparés aux systèmes d’administration neutres ou anioniques, les systèmes d’administration cationique ont des capacités d’encapsulation et d’administration d’antigènes relativement efficaces, ce qui peut améliorer l’immunogénicité des antigènes 7,8,9. La charge cationique de surface d’une variété de systèmes adjuvants est importante pour leurs effets adjuvants 10,11,12. La charge cationique est un facteur important dans la prolongation de la rétention du vaccin au site d’injection, l’augmentation de la présentation de l’antigène et la stimulation de l’immunité cellulaire dans le corps12.
Sur la base des considérations ci-dessus, nous avons développé une nanoémulsion cationique pour co-administrer efficacement la PR et les antigènes. La taille des particules et le potentiel zêta de la nanoémulsion ont été déterminés à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS), et les réponses immunitaires systémiques et muqueuses de la nanoémulsion combinée à l’OVA ont été évaluées par injection intramusculaire13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous avons développé un acide rétinoïque encapsulé dans une nanoémulsion cationique à utiliser comme adjuvant pour favoriser les réponses systémiques et muqueuses spécifiques de l’antigène. Par rapport aux adjuvants NE traditionnels, il présente les deux avantages suivants. Tout d’abord, en général, la surface des EN H/E a une charge négative élevée, ce qui rend difficile la charge directe des antigènes. Les ENs cationiques peuvent adsorber efficacement les antigènes peptidiques …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par le programme clé de la Fondation des sciences naturelles de Chongqing (n° cstc2020jcyj-zdxmX0027) et le projet de la Fondation nationale chinoise des sciences naturelles (n° 32270988).
Materials
| 1640 medium | GIBCO, USA | C11875500BT | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab171529-1000 mL | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| DOTAP | CordenPharma, Switzerland | O02002 | |
| ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP) | mabtech | ab205719 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1(HRP) | Abcam | ab97240-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP) | Abcam | ab97235-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | Ab205720-500ug | |
| Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP) | Abcam | ab97245-1mg | |
| High pressure homogenizer | ATS | ||
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| OVA323-339 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| retinoic acid | TCI, Japan | TCI-R0064-5G | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| T10 basic Ultra-Turrax | IKA, Germany | ||
| TMB ELISA Substrate | Abcam | ab171523-1000ml | |
| trypsin inhibitor | Diamond | A003570-0100 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 |
Referencias
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