Imágenes de lámina de luz 4D de la contracción cardíaca del pez cebra
Summary
Este protocolo utiliza imágenes de láminas de luz para investigar la función contráctil cardíaca en larvas de pez cebra y obtener información sobre la mecánica cardíaca a través del seguimiento celular y el análisis interactivo.
Abstract
El pez cebra es un organismo modelo intrigante conocido por su notable capacidad de regeneración cardíaca. El estudio de la contracción del corazón in vivo es esencial para obtener información sobre los cambios estructurales y funcionales en respuesta a las lesiones. Sin embargo, la obtención de imágenes de alta resolución y alta velocidad en 4 dimensiones (4D, 3D espacial + 1D temporal) del corazón del pez cebra para evaluar la arquitectura cardíaca y la contractilidad sigue siendo un desafío. En este contexto, se utiliza un microscopio de lámina de luz (LSM) interno y un análisis computacional personalizado para superar estas limitaciones técnicas. Esta estrategia, que implica la construcción del sistema LSM, la sincronización retrospectiva, el seguimiento de una sola célula y el análisis dirigido por el usuario, permite investigar la microestructura y la función contráctil en todo el corazón a la resolución de una sola célula en las larvas de pez cebra transgénicas Tg (myl7: nucGFP ). Además, somos capaces de incorporar aún más la microinyección de compuestos de moléculas pequeñas para inducir lesiones cardíacas de forma precisa y controlada. En general, este marco permite rastrear los cambios fisiológicos y fisiopatológicos, así como la mecánica regional a nivel de una sola célula durante la morfogénesis y la regeneración cardíacas.
Introduction
El pez cebra (Danio rerio) es un organismo modelo ampliamente utilizado para estudiar el desarrollo, la fisiología y la reparación cardíaca debido a su transparencia óptica, trazabilidad genética y capacidad regenerativa 1,2,3,4. En el caso del infarto de miocardio, si bien los cambios estructurales y funcionales impactan la eyección cardíaca y la hemodinámica, las limitaciones técnicas continúan dificultando la capacidad de investigar el proceso dinámico durante la regeneración cardíaca con la alta resolución espacio-temporal. Por ejemplo, los métodos convencionales de imagen, como la microscopía confocal, tienen limitaciones en cuanto a la profundidad de la imagen, la resolución temporal o la fototoxicidad para capturar los cambios dinámicos y evaluar la función contráctil cardíaca durante múltiples ciclos cardíacos5.
La microscopía de lámina de luz representa un método de imagen de última generación que aborda con éxito estos problemas al barrer rápidamente el láser a través del ventrículo y la aurícula del corazón, logrando imágenes detalladas con una resolución espacio-temporal mejorada y efectos foto-blanqueadores y fototóxicos insignificantes 6,7,8,9,10,11.
Este protocolo introduce una estrategia integral de imágenes que incluye la construcción del sistema LSM, la reconstrucción de imágenes 4D, el seguimiento celular en 3D y el análisis interactivo para capturar y analizar la dinámica de los cardiomiocitos en todo el corazón durante múltiples ciclos cardíacos12. El sistema de imágenes personalizado y la metodología computacional permiten rastrear la microestructura miocárdica y la función contráctil a nivel de una sola célula en larvas transgénicas de pez cebra Tg(myl7:nucGFP). Además, se administraron compuestos de moléculas pequeñas en los embriones mediante microinyecciones para evaluar la lesión cardíaca inducida por fármacos y la posterior regeneración. Esta estrategia holística proporciona un punto de entrada para investigar in vivo las propiedades estructurales, funcionales y mecánicas del miocardio a nivel de una sola célula durante el desarrollo y la regeneración cardíaca.
Protocol
Representative Results
Discussion
La integración del modelo del pez cebra con métodos de ingeniería tiene un inmenso potencial para la exploración in vivo del infarto de miocardio, las arritmias y los defectos cardíacos congénitos. Aprovechando su transparencia óptica, capacidad regenerativa y similitudes genéticas y fisiológicas con los humanos, los embriones y larvas de pez cebra se han utilizado ampliamente en la investigación 1,2,4. La res…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Expresamos nuestra gratitud a la Dra. Caroline Burns del Boston Children’s Hospital por compartir generosamente el pez cebra transgénico. Agradecemos a la Sra. Elizabeth Ibáñez por su ayuda en la cría del pez cebra en UT Dallas. También agradecemos todos los comentarios constructivos proporcionados por los miembros de la incubadora D en UT Dallas. Este trabajo fue apoyado por NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) y el programa UT Dallas STARS (Y.D.).
Materials
| RESOURCE | SOURCE/Reference | IDENTIFIER |
| Animal models | ||
| Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish | Burns Lab in Boston Children's Hospital | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 |
| Software and algorithms | ||
| MATLAB | The MathWorks Inc. | R2023a |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 |
| Python | The Python Software Foundation | 3.9.0 |
| Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f |
| 3DeeCellTracker | Chentao Wen et al.15 | v0.5.2 |
| Unity | Unity Software Inc. | 2020.3.2f1 |
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 |
| 3D Slicer | Andriy Fedorov et al.17 | 5.2.1 |
| ITK SNAP | Paul A Yushkevich et al.16 | 4 |
| Light-sheet system | ||
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A |
| 4X Illumination objective | Nikon | MRH00045 |
| 20X Detection objective | Olympus | 1-U2M585 |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU |
| Motorized XYZ stage | Thorlabs | PT3/M-Z8 |
| Two-axis tilt stage | Thorlabs | GN2/M |
| Rotation stepper motor | Pololu | 1474 |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow | R471003GX |
| 532nm DPSS laser | Laserglow | R531003FX |
| Microinjector and vacuum pump | ||
| Microinjector | WPI | PV850 |
| Vacuum pump | Welch | 2522B-01 |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT |
| Capillary tip for gel loading | Bio-Rad | 2239912 |
| Virtual reality hardware | ||
| VR headset | Meta | Quest 2 |
| 30mg/L PTU solution | ||
| PTU | Sigma-Aldrich | P7629 |
| 1X E3 working solution | – | – |
| 1% Agarose | – | – |
| Low-melt agarose | Thermo Fisher | 16520050 |
| Deionized water | – | – |
| 10g/L Tricaine stock solution | ||
| Tricaine | Syndel | SYNC-M-GR-US02 |
| Deionized water | – | – |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 |
| 150mg/L Tricaine working solution | ||
| 10g/L Tricaine stock solution | – | – |
| Deionized water | – | – |
| 60X E3 stock solution | ||
| Sodium Chloride | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | NaCl |
| Potassium Chloride | – | KCL |
| Calcium Chloride Dihydrate | – | CaCL2 x 2H2O |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | – | MgSO4 x 7H2O |
| RO Water | – | – |
| 1X E3 working solution | ||
| 60X E3 stock solution | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | – |
| RO Water | – | – |
| 1% Methylene Blue (optional) | – | C16H18ClN3S |
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