Summary

Uso de un sistema de perfusión tisular in vitro para detectar las actividades funcionales de tubos intestinales aislados en tiempo real

Published: July 26, 2024
doi:

Summary

Presentamos un método para aislar los tubos intestinales de ratas y evaluar el impacto de los fármacos sobre su tensión, frecuencia y amplitud in vitro. Este método ofrece un enfoque valioso para los investigadores que investigan los tubos intestinales.

Abstract

Las enfermedades gastrointestinales, que tienen una alta incidencia, plantean desafíos considerables para los seres humanos. El intestino delgado es parte integral de la digestión y absorción de alimentos y medicamentos y desempeña un papel crucial en el tratamiento de estas enfermedades. El experimento del movimiento del tubo intestinal, un método in vitro común y esencial, se utiliza para estudiar la dinámica gastrointestinal. Esto incluye la preparación del tubo intestinal aislado, así como la suspensión del tubo intestinal preparado en el baño y su conexión a un detector de señales. A continuación, se registran y analizan una serie de parámetros, como la tensión, que pueden utilizarse para evaluar la función motora intestinal, así como consideraciones para mantener el tubo intestinal activo in vitro. El programa estandarizado desde el muestreo hasta la recolección de datos mejora en gran medida la repetibilidad de los datos experimentales y garantiza la autenticidad del registro de la tensión intestinal después de la intervención fisiológica, patológica y farmacológica. Aquí presentamos los problemas clave en la operación experimental y un valioso protocolo experimental de referencia para el estudio de fármacos que regulan la motilidad gastrointestinal.

Introduction

Las enfermedades gastrointestinales, una afección prevalente, afectan gravemente la vida y la salud humanas1. El trastorno de la motilidad gastrointestinal es una parte importante de las enfermedades gastrointestinales funcionales, que se manifiesta principalmente en síntomas debilitantes, retraso en el vaciamiento gástrico y problemas gástricos graves2. Puede alterar la coordinación gastrointestinal, dificultar el vaciado gástrico, afectar la intolerancia alimentaria intestinal e incluso causar obstrucción funcional en el intestino delgado o grueso3. Para los pacientes que se someten a una cirugía gastrointestinal, este trastorno puede conducir directamente a la insuficiencia intestinal. Además, el trastorno intestinal no solo está relacionado con enfermedades gastrointestinales, sino también con los factores patogénicos de otras enfermedades, como la hepatitis y las enfermedades del sistema nervioso central. Las comunidades microbianas intestinales desempeñan un papel regulador crucial en la fisiología intestinal, incluida la motilidad, que posteriormente influye en la colonización dentro del ecosistema microbiano4. A medida que la infección por el virus de la hepatitis B progresa a hepatitis B crónica, hay diversos grados de cambios en la flora intestinal. La modulación de la flora intestinal ha demostrado beneficios en el tratamiento del virus de la hepatitisB 5. Además, el sistema nervioso central puede influir en el intestino y alterar su composición microbiana. Los avances recientes en la tecnología de secuenciación de la microflora han descubierto interacciones bidireccionales entre la microflora intestinal y la función del sistema nervioso central, estrechamente asociadas con la aparición y progresión de enfermedades del sistema nervioso central 6,7.

Con el envejecimiento de la sociedad, la incidencia del trastorno de la motilidad gastrointestinal está aumentando, vinculado a la disminución o pérdida de la función neuronal en el sistema nervioso entérico y la inervación intrínseca del intestino8. A medida que se amplía nuestra comprensión de las enfermedades gastrointestinales, surgen numerosas ideas y enfoques novedosos, que podrían conducir al desarrollo de nuevos fármacos. Sin embargo, muchas de estas ideas aún son hipotéticas o están a la espera de resultados positivos en ensayos clínicos para materializarse 9,10. Los métodos de investigación eficaces son cruciales para superar las enfermedades gastrointestinales. En los últimos años, una amplia investigación se ha centrado en los fármacos gastrointestinales y la regulación de la motilidad. Los fármacos gastrointestinales y la dinámica gastrointestinal son inseparables, y muchos otros fármacos sistémicos tienen efectos variables sobre la dinámica gastrointestinal. Por ejemplo, los medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) se utilizan para el dolor y la inflamación y el movimiento gastrointestinal lento, lo que aumenta el riesgo de úlcera péptica11. Por otro lado, algunos antidepresivos pueden afectar la motilidad gastrointestinal12. En la actualidad, el principal experimento farmacológico in vitro que estudia los efectos de los fármacos gastrointestinales y otros fármacos sistémicos sobre la motilidad gastrointestinal es el ensayo de movimiento intestinal in vitro 13. Mediante la simulación de condiciones fisiológicas, observan el impacto directo de los fármacos en la contracción y relajación del músculo liso intestinal, evaluando sus efectos gastrointestinales. Sin embargo, la causa precisa de los trastornos de la motilidad gastrointestinal sigue sin estar clara, probablemente una interacción compleja de factores genéticos, ambientales, dietéticos y neuroendocrinos. En consecuencia, el tratamiento de los trastornos de la motilidad gastrointestinal sigue planteando importantes desafíos.

El intestino delgado, al ser un sitio crucial para la digestión, la absorción y el metabolismo de los medicamentos, tiene importancia en la función gastrointestinal. Como resultado, la prueba de movimiento del tubo intestinal aislado es una herramienta esencial para el estudio de las enfermedades gastrointestinales. Esto implica preparar y colocar el tubo intestinal aislado del animal en un baño, conectarlo a un intercambiador de energía, utilizar un transductor para convertir los movimientos mecánicos en señales eléctricas para su amplificación y registrarlo mediante un registrador fisiológico. Se pueden medir varios parámetros, como la frecuencia, la amplitud promedio de la vibración, la tensión y el área debajo de la curva para evaluar la función motora del tubo intestinal. Este método ofrece ventajas como simplicidad, viabilidad económica, fácil control de las condiciones experimentales, factores de influencia mínimos, alta reproducibilidad y resultados precisos y confiables. Además, es particularmente útil para investigar el mecanismo de acción de los medicamentos. Sin embargo, existen desafíos notables en el funcionamiento del experimento del tubo intestinal aislado, por ejemplo, la actividad intestinal es difícil de mantener durante mucho tiempo. Para abordar estos problemas y aprovechar las experiencias en experimentos in vitro , este artículo proporcionará una introducción detallada a los problemas clave en la operación experimental y presentará un valioso protocolo experimental de referencia para el estudio de fármacos que regulan la motilidad gastrointestinal.

Protocol

Este protocolo se deriva de la literatura previamente publicada 14,15,16,17. Para el presente estudio se utilizaron ratas macho Sprague Dawley (SD) (260-300 g, 8-10 semanas de edad). El protocolo animal fue revisado y aprobado por el Comité de Gestión de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Registro Nº 2023017). Antes del experimento, se instruyó a las ratas para que ayunaran durante 24 horas. Durante el experimento, las ratas se mantuvieron en una cámara de animales y tuvieron libre acceso a comida y agua. 1. Preparación de la solución Prepare una solución salina fisiológica (PSS) que contenga 118 mM de NaCl, 4,7 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1,2 mM de KH2PO4, 1,2 mM de MgCl2∙6H2O, 25 mM de NaHCO3, 11 mM de D-glucosa y 5 mM de HEPES (véase la Tabla de Materiales). Sature las soluciones y burbujee con un gas mezclado de 95%O2 y 5% de CO2. Mientras tanto, mantenga los valores de pH de la solución entre 7,38 y 7,42 con 2 mM de NaOH. Preenfriar 1/3 del PSS a 4 °C y precalentar el resto a 37 °C para experimentos posteriores.NOTA: el PSS se preparó originalmente a temperatura ambiente en los pasos 1.1-1.2 2. Disección del canal intestinal de la rata Reúna placas de Petri llenas de PSS a 4 °C, pinzas quirúrgicas y tijeras. Administrar isoflurano al 2% para anestesiar a la rata por inhalación durante aproximadamente 5 min. Verifica que la rata esté profundamente anestesiada realizando una prueba de pellizco en los dedos de los pies. Si es necesario, administre anestésicos adicionales. A continuación, exponga el canal intestinal abriendo la cavidad abdominal sobre una mesa de operaciones. Coloque rápidamente los tubos del estómago y del intestino en una placa de Petri llena de PSS a 4 °C (pH 7,40) con un 95% deO2 y un 5% de CO2 saturado. Localiza el duodeno, que es el comienzo del intestino delgado, en el píloro del estómago. Con unas pinzas, levante delicadamente el pañuelo adyacente y recórtelo cuidadosamente lejos del borde del intestino con unas tijeras. Posteriormente, divida el intestino en segmentos de 1-2 cm; todo este proceso se ilustra en la Figura 1. 3. Suspensión y fijación del canal intestinal (Figura 2) Encienda el sistema de perfusión de tejidos in vitro y ajuste la temperatura del baño en el instrumento a 37 °C. Coloque el PSS (37 °C) en la bañera. Preparar una sutura quirúrgica de 15 cm (ver Tabla de Materiales) y sumergirla en PSS a 4 °C saturado con 95% deO2 + 5% de CO2. Con la sutura, asegure un extremo del canal intestinal y use un gancho de aguja de acero para asegurar el otro extremo. Instala el tubo intestinal. Monte el segmento con el gancho de aguja de acero en la parte inferior del baño y conecte el otro extremo de la línea quirúrgica al transductor. Encienda el interruptor de gas para permitir que emerjan burbujas en el baño. Abra el software de adquisición de datos (consulte la Tabla de materiales) y haga clic en Iniciar para asegurarse de que se está registrando la señal de ruta correspondiente. 4. Normalización Gire el eje en espiral del baño en sentido contrario a las agujas del reloj para relajar los tubos intestinales a su estado natural. Haga clic en Configuración-Cero todas las entradas para asegurarse de que la tensión inicial del tubo intestinal esté configurada en 0 g en el software. Gire el eje en espiral del baño en sentido contrario a las agujas del reloj para llevar el valor de tensión a 1 g y estabilizarlo en el pH = 7,40, 95% O2 + 5% CO2 saturado 37 °C PSS durante 30 min.NOTA: La normalización del tubo intestinal consiste en ajustar su precarga a un estado óptimo. Para las muestras de cavidad, era necesaria una precarga óptima para mantener una actividad excepcional in vitro. La precarga óptima del tubo intestinal de rata fue de 1 g18. 5. Detección de reactividad Observe las ondas de contracción rítmicas espontáneas en el software y proceda al siguiente experimento, ya que esto indica una respuesta suficiente. 6. Observación experimental Agregue el fármaco de prueba (por ejemplo, acetilcolina, etc.) al baño para estudiar el efecto del fármaco sobre la función del tubo intestinal.NOTA: El efecto del fármaco se evaluó comparando los cambios antes y después de la administración en la curva de constricción intestinal. Cuando se agrega el medicamento, es apropiado aumentar la burbuja para mezclar el medicamento y luego ajustar la burbuja a la normalidad después de mezclar. 7. Análisis de datos NOTA: El sistema de perfusión tisular in vitro tiene cuatro canales que pueden realizar pruebas simultáneamente sobre los efectos de cuatro medicamentos idénticos o diferentes en cuatro tubos intestinales. Dado que los parámetros experimentales y los métodos de análisis son los mismos para todos los canales, se selecciona un canal como ejemplo para el análisis de datos. Detenga el software de adquisición de datos y realice el análisis de datos en este software de adquisición de datos. Edite la tarjeta de datos y seleccione los parámetros de análisis de la siguiente manera: Haga clic en Window-Data Pad y elija la tensión media para el canal. Seleccione la curva de contracción antes de la administración y haga clic en Agregar al panel de datos; seleccione la curva de contracción después de la administración y haga clic en Agregar al panel de datos. El valor de tensión promedio antes y después de la administración aparecerá a su vez en el panel de datos. Haga clic en Window-Data Pad para copiar los datos a otro software de análisis estadístico (consulte la Tabla de materiales) para el análisis estadístico. Analice otros parámetros, como la amplitud promedio, la frecuencia promedio y la integral (área bajo la curva), simplemente reemplace la tensión promedio con el parámetro respectivo y la operación es la misma que los pasos 6.1-6.3. Guardar curva de contracción: Seleccione la curva de contracción, haga clic en Editar-Copiar datos de Labchart para copiar los datos al software de dibujo (consulte la Tabla de materiales) para dibujar la curva de contracción. 8. Tratamiento postquirúrgico Después de la cirugía, eutanasiar a los animales siguiendo los protocolos aprobados por la institución.NOTA: Para el presente estudio, los animales fueron sacrificados inhalando el exceso de isoflurano.

Representative Results

La primera parte del estudio se centra en el proceso de separar tubos intestinales aislados del cuerpo y convertirlos en tubos de 2 cm in vitro. Este proceso se ilustra en detalle en la Figura 1. La segunda parte consiste en la suspensión y estandarización del anillo de tubo intestinal aislado. El éxito de este proceso se demuestra en la Figura 2, que muestra la contracción rítmica automática de un tubo normal. Po…

Discussion

La motilidad gastrointestinal se logra mediante una serie de contracciones y relajaciones del músculo liso coordinadas con precisión. Este proceso implica la contracción rítmica de un grupo de grupos musculares, la contracción coordinada de múltiples grupos y una contracción propulsiva especial20,21. La aparición de trastornos de la motilidad gastrointestinal puede estar asociada a disfunciones a diferentes niveles, como …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Programa Especial de Talentos de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu para el “Plan de Promoción de la Investigación de Talentos Xinglin Scholars and Discipline” (33002324).

Materials

Acetylcholine  Sigma, USA A6625
atropine Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China IA06501
Barium chloride Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China B861682
CaCl2 Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China A501330
D-glucose Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China A610219
drawing software GraphPad Software, San Diego, California, USA
Epinephrine Sigma, USA E4642
HEPES Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China S3872
In vitro tissue perfusion system PowerLab, ADInstruments, Australia ML0146
KCl Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China A100395
KH2PO4 Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China A100781
LabChart Professional version 8.3  ADInstruments, Australia
MgCl2·6H2O Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China A100288
NaCl Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China A100241
NaHCO3 Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China A100865
nifedipine Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China N5087
statistical analysis software GraphPad Software, San Diego, California, USA
Surgical sutures Johnson, USA

Referencias

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Citar este artículo
Guo, P., An, W., Wang, Y., Ren, Y., Zhang, S. Using An In Vitro Tissue Perfusion System to Detect the Functional Activities of Isolated Intestinal Tubes in Real Time. J. Vis. Exp. (209), e66243, doi:10.3791/66243 (2024).

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